분자생물학실험 | 세균의 형질전환

 

 

 

Transformation의 원리

E.coli는 linear 또는 circular DNA를 받아들일 수 있는데, 이러한 과정을 transformation이라 하며 다음과 같은 단계를 거쳐 이루어진다. E.coli cell이 DNA를 uptake 할 수 있는 상태(competent)로 만들어 주기위해 E.coli cell을 Ca과 같은 multivalent ion의 존재 하에 0℃에서 incubation한다. 이때, cation은 E.coli cell membrane에 존재하는 lipid의 negatively charged phosphate와 complex를 이룰 것으로 추정된다.

 

낮은 온도는 cell membrane을 응고시켜 charged phosphate의 분포를 안정화하여 cation에 의하여 효과적으로 shield되게 하여준다. 이때 37℃~42℃로 heat shock을 가하면 E.coli membrane내외의 thermal imbalance가 생겨 DNA가 세포 안으로 빨려 들어가게 된다. 이외에 electroporation에 의한 transformation으로 electric charge를 E.coli cell에 순간적으로 가하여 이때 생긴 pore를 통해 DNA를 세포 안으로 넣는 방법이 있다. Host cell로 들어간 DNA는 ampicillin내성 유전자(Beta lactamase를 cording하는 유전자)가 포함된 plasmid를 사용하여 ampicillin이 포함된 배지에서 선별해서 확인한다.

 

 

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) E.coli 균주를 키운 페트리접시에서 단일 콜로니를 따서 LB배지에 5㎖ 접종하여 37℃에서 16～20시간 배양.

 

2) 100LB 배지가 담긴 1L 삼각플라스크에 배양액 1㎖을 접종.(1/100=1%)

 

3) 37℃ 회전식 교반기에서 세게 흔들어 주면서 키우다가 OD₆₀₀ 이 0.3～0.4정도가 되면 배양을 끝냄.

 

4) 배양액을 50㎖ 원심관(Centrifuse)으로 옮긴 다음 10분간 얼음에 놓아둔다.

 

5) 원심관을 4000rpm으로 4℃에서 10분간 돌린다.

 

6) Sup을 버리고 미리 차게해둔 0.1M CaCl₂ 10㎖와 섞은다음

 

7) 다시 4000rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리

 

8) Sup완전히 제거하고 0.1M CaCl₂ 2㎖과 pellet을 섞는다.

 

9) 멸균된 Microfuse tube에 200㎕씩 나누어 놓는다. 여기에 DNA를 가하여 섞고 on ice(30min.)

 

10) 이 혼합물은 42℃ 항온 수조에서 90초간 놓아 둔다.(Heat Shock) 그 후 얼음에 옮겨 1～2분간 보관

 

11) LB배지 800㎕를 각 튜브에 넣어 37℃ 진탕 배양기에 45분간 놓아둔다. (배양시간은 한시간이 넘지않게)

 

12) Selectable marker에 해당하는 항생제가 포함된 LB agar평판에 적당량의 세포를 골고루 펴서 말린다.

 

13) 페트리접시를 뒤집어서 37℃에서 배양. 12～16시간 후에는 형질 전환 된 콜로니가 생길 것이다.

 

 

 

[분자생물학실험]세균의 형질전환 레포트