화공생물공학기초실험 | 유산균 음료로부터 미생물 분리

 

 

 

실험 방법

1. 그람 염색법

1) 균체를 슬라이드글라스에 도말하여 고정시킨다. 균체를 진하게 한 곳과 연하게 한 곳이 있도록 만들면 좋다.

 

2) 제1액으로 1분간 염색한 다음 물로 씻는다.

 

3) 제2액으로 1분간 담근 다음, 물로 씻는다. 제2액을 떨어뜨린 다음 즉시 이것을 버리고 다시 제2액을 떨어뜨려 1분간 담그면 좋다.

 

4) 제2액을 물로 씻은 다음, 살짝 여과지로 물기를 제거하고 완전하게 건조하기 전에 95% 에탄올 중에 살짝 흔들면서 30초 동안 탈색한다.

 

5) 건조를 한 다음 제3액으로 30-40초 동안 염색하고 물로 씻는다.(대비염색)

 

6) 현미경으로 관찰한다.

 

2. BCP Agar의 제조(BCP 24.64g/L)

1) 위의 시약을 150㎖ 제조할 때 해당하는 양을 계산하여 유리 보틀에 넣은 후 150㎖의 증류수를 넣고 잘 저어준다.(완전히 녹지 않으므로 잘 섞일 때까지만 젓는다.)

 

2) 위의 용기의 입구를 알루미늄 호일로 잘 감싼다.(뚜껑을 꽉 닫지 않도록 유의한다.)

 

3. NaCl 희석수 제조(NaCl 0.0085g/㎖)

1) 위의 시약을 100㎖ 제조할 때 해당하는 양을 계산하여 비커에 넣은 후 100㎖의 증류수를 넣고 완전히 녹인다.

 

4. 멸균

1) 만든 BCP agar 배지용액과 NaCl 희석수를 멸균기에 넣는다. (뚜겅을 꽉 닫지 않도록 반드시 유의하며, 입구 부분은 모두 호일로 잘 감싼다.)

 

2) 멸균기에 121℃에서 15분을 멸균한다. (반드시 조교 동행)

 

3) 멸균이 끝나는 시간에 반드시 맞춰서 온도를 체크하고, 온도가 60도가 될 때까지 기다렸다가 꺼낸다. 멸균 후에는 오염되지 않도록 주의한다. (온도가 내려가게 되면 agar 배지가 쉽게 굳으므로, 멸균기를 수시로 체크하여 온도 및 시간을 확인한다. 이후 실험을 클린벤치에서 진행한다.)

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5. 배지 제조

1) 클린 벤치 내 멸균 상태로 만들어 주는 UV 등을 끈 후, 알코올램프를 켠다. 클린 벤치 내에서 호일을 벗긴 후 agar가 들어있는 용기 입구를 겉불꽃에 살짝 가져가 멸균한다. (클린 벤치 내에 들어가는 모든 것들은 모두 에탄올을 뿌려 소독시켜야 한다. 장갑을 낀 손과 멸균시킨 용기들을 모두 에탄올로 뿌린 후, 클린 벤치 내에서 실험해야 오염을 막을 수 있다.)

 

2) BCP Agar 용액이 40-50도 정도로 식었을 때(따뜻한 정도), 거품이 나지 않도록 흔들어 가면서 petri dish의 절반 정도씩 채워 6개의 plate를 만든다.

 

3) 평평하게 유지되도록 두고 뚜껑을 연 상태로 30분 정도 배지가 굳을 때까지 기다린다.

 

6. 미생물 희석 및 평판도말

1) 가져온 유산균 음료를 희석한다. 유산균 음료를 약 500㎕ 덜어낸 후 준비한 0.85% NaCl이 들어있는 15㎖ conical tube에 넣어준 후 잘 섞일 때까지 피펫팅을 통해 섞어준다. 이 때, 용액이 tube 뚜껑에 닿지 않도록 주의한다.

 

2) 10^-6까지 NaCl 희석수를 이용하여 희석한다.

 

3) 10^-5, 10^-6에 해당하는 희석 용액을 준비한 BCP agar에 100㎕씩 각각 3개의 plate에 점적 후 spreader을 이용하여 완전히 배지에 흡수될 때까지 잘 문지른다. 완료된 petri dish 뚜껑에 날짜, 실험반 및 조를 적는다.

 

4) 37℃ 인큐베이터에서 뒤집은 상태로 2-4일 배양 후 콜로니 수를 확인한다.

 

7. 유산균 수 측정

1) 인큐베이터에서 배양된 균의 콜로니들 중에서 배지의 색이 노랗게 변한 콜로니의 수를 센다.

 

2) 희석된 양을 역으로 계산하여 초기 샘플의 유산균의 수를 대략적으로 추정한다. (희석이 잘 되었다면 10-5와 10^-6 희석용액의 콜로니 수가 10배 차이 나야 한다.

 

 

 

[화공생물공학기초실험]유산균 음료로부터 미생물 분리 레포트