분자생물학실험 | 형질전환 - 세균세포에 의한 DNA uptake

 

 

 

TIP

 

 

외부의 DNA를 세균에 삽입하는 실험을 통해 세균의 형질전환(transformation)에 대해 이해하도록 한다.

 

 

 

대부분의 세균 종들은 그들이 성장하는 배지로부터 DNA분자를 uptake할 수 있다. 이러한 방법으로 uptake된 DNA분자는 분해되지만(restriction and modification에 의해) 종종 생존하여 복제될 수 있다. 특히 이러한 현상은 그 DNA분자가 숙주에 의해 인식될 수 있는 복제 원점(replication origin)을 가지고 있는 플라스미드인 경우 나타난다.

 

플라스미드의 uptake와 안정적인 보존은 플라스미드가 가지고 있는 유전자의 발현을 관찰함으로써 탐지된다. 항생제에 민감한 세균 세포가 항생제-저항성 유전자를 가진 플라스미드를 uptake하여 이 유전자가 발현된 경우, 이 세균 세포의 항생제에 대해 민감한 형질은 저항성을 나타내는 형질로 전환된 것이다.(transform) 최근 형질전환이라는 용어는 의미가 확장되어 어떤 유형의 세포에 의한 어떤 DNA분자의 uptake 전부를 지칭하고 있다.

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) 형질전환 competent cell 까지의 단계를 미리 준비하였다.

① Tetracycline이 12.5㎎/㎖로 포함된 LB 배지로 XL1-Blue을 37 ℃에서 18 시간 진탕배양한다. (TCr유전자가 없는 JM계열 대장균은 episome 유지를 위하여 MINIMAL MEDIA에서 배양)

② XL1-Blue을 tetracycline이 포함된 LB 배지로 100 배 희석하여 600nm에서의 흡광도가 0.3에 이를 때까지 다시 배양한다.

③ 얼음 속에서 10분간 방치한 후 얼음 속에서 보관 중이던 0.1M 로 1회 세척하여 상청액을 버린다.

④ 배양한 배지의 반 부피가 되게 0.1 M 를 첨가하여 대장균을 부유한다.

⑤ 얼음 속에서 1 시간 방치한 후 4˚C에서 20분간 4,000xg로 원심하여 상청액을 버린다.

⑥ 배양한배지 1/10 부피의 0.1M 로 부유하여 이를 형질전환에 사용한다.

 

2) competent cell 100㎕를 eppendorf tube에 옮기고 plasmid DNA 2～5㎕을 첨가하여 얼음이 든 ICE 박스에서 30분간 정치한다.

손을 깨끗이 씻고 작업 시 손을 깊숙이 넣어 오염을 최소화 한다.

 

3) 42℃ water bath에서 heat shock 90초간 실시한다.

시간은 정확해야 하고 water bath의 작은 물결도 일으키지 말아야한다. 이 과정에서 cell은 형질전환 되므로 cell에 스트레스를 주지 않도록 실험 시 매우 조심해야한다.

 

4) eppendorf tube를 흔들림 없이 ice로 옮겨 2～3분간 정치시키면서 cell을 안정화한다.

 

5) LB broth 1㎖을 무균적으로 첨가 한 후, 37℃에서 60～90분간 shaking incubation한다. (원래보다 낮은 150～200rpm 으로)

 

6) spreader를 화염멸균한 후 LB plate에 spreading한다.

 

7) plate에 나눠 떨어뜨린 후 골고루 문지르면서 다 스며들 때까지 한다. 보통 뻑뻑한 감이 있으면 다 완료된 경우이다.

 

8) 대조군으로 형질전환을 과정을 거치지 않은 competent cell을 LB plate에 spreading한다.

 

 

 

[분자생물학실험]형질전환 - 세균세포에 의한 DNA uptake 레포트