분자생물학실험 | Transformation

 

 

 

TIP

 

 

1. 실험을 통하여 transformation의 과정을 이해하고, x-gal의 사용하여 transformation의 유무를 판단한다
2. 재조합된 DNA를 competent cell에 삽입하여 형질전환 후, ampicillin과 x-gal이 들어 있는 LB plate에서 배양하여 colony를 형성시킨 후, 색깔로 재조합 DNA를 판별한다.
3. 형질전환 기술을 익힌다.
4. Lac Operon의 Mechanism을 이해한다.

 

 

 

오페론 (0peron)

유전자 발현의 조절 단위 (operation unit). 오페론은 대부분의 경우 원핵생물에만 존재한다. 여러 유전자를 오페론으로 묶어 한꺼번에 발현을 조절하면 유전자들의 발현이 쉽게 조절될 수 있다.

 

1. 오페론의 구조 : 조절부위 + 구조부위 (전사되는 유전자 부위)

LacI – repressor 단백질 생성, CAP binding site (Catabolite Activator Protein)

Promoter(P), Operator(O)

Structural gene(lacZ, lacY, lacA) : 대사에 필요한 효소들을 코딩하고 있는 부분

Lac오페론의 on/off는 LacI와 Crp의 활성여부에 달려있다.

 

 

① 오페론이 꺼진 상태(젖당이 없을 때)

억제자(repressor) 단백질이 operator에 붙어서 RNA중합효소가 프로모터에 붙는 것을 물리적으로 방해하므로 전사는 일어나지 않는다. 억제자를 암호화하고 있는 조절유전자는 오페론의 밖에 위치하고 있어 오페론의 영향을 받지 않으며 항상 발현되어 적은 양의 억제자를 항상 제공한다.

 

 

② 오페론이 켜진 상태(젖당이 억제자를 불활성화한다)

젖당은 억제자와 결합하여 억제자의 모양을 변형시킴으로써 억제자가 프로모터에 붙는 것을 방해한다. 억제자의 형태가 변형되면 operator와 결합할 수 없고, 따라서 operator의 스위치가 켜진 상태가 된다. 이렇게 되면 CAP binding site에 CAP가 붙어서 RNA중합효소의 전사를 촉진한다.

 

RNA중합효소가 프로모터에 결합하여 유전자를 따라 이동하며 RNA를 전사하여 만들어진 mRNA는 젖당분해에 필요한 효소 3개 모두를 암호화하는 염기서열을 갖고 있다. 이 mRNA는 3개의 단백질 해독을 시작하고 멈추게 하는 코돈을 각각 가지고 있으므로 세포는 이 한 분자의 mRNA를 해독하여 3개의 각각의 단백질을 만들 수 있다.

 

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) T-blunt 반응액 3～6㎕를 competent cell 100㎕에 조심히 넣는다. (pipetting하면 안됨)

 

2) 얼음에서 10～30min 반응시킨다.

 

3) 42℃에서 30초간 heat shock을 주고 바로 얼음에 담가 2분간 안정화한다.

 

4) LB 배지(Amp+) 900㎕를 첨가한다.

 

5) tube 뚜껑을 닫고 37℃에서 1시간 200rpm으로 흔들어주며 배양한다.

 

6) 200～500㎕를 취해서 Amp+ LB 고체배지에서 밤새 배양한다.(IPTG, X-gal처리)

 

7) colony 선별 후 plasmid DNA를 prep한다.

 

 

 

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