Agrobacterium 형질전환
외래 유전자가 작물 내로 도입되는 현상은 토양내에 존재하는 미생물인 아그로박테리움을 볼 수 있다. 이 미생물은 토양속의 양분이 부족해지면 식물에 침투하여 기생하는 특성을 가지고 있는데, 이때 자신이 가진 플라스미드 DNA의 일부(T-DNA라고 불리는 부분)를 절단하여, 이 유전자를 식물의 genome내에 도입하여 생장조절제와 아미노산을 만들도록 한다.
식물체의 줄기 혹은 뿌리에 근두암종병(Crown gall)이라는 비정상적인 혹이 생기는 이유는 아그로박테리움의 유전자가 식물체에 옮겨져 생물생장조절제의 작용에 의해 세포분열이 촉진되기 때문이다. 이처럼 자신의 유전자중 일부를 식물에 옮기는 현상을 알아낸 과학자들은 유용한 유전자를 아그로박테리움을 이용하여 식물에 도입하려 하고 있다.
우선 플라스미드 중에서 근두암종병을 만드는 유전자(T-DNA영역)를 제거한 후 그 부분에 목적으로 하는 유용유전자를 연결시킨다. 그리고 유용유전자를 가진 플라스미드를 아그로박테리움에 집어넣고, 이 아그로박테리움을 식물세포에 접촉, 감염시켜 목적하는 유용유전자를 식물안으로 넣는다. 이 과정을 통해 유용유전자를 식물세포의 염색체에 끼워 유용유전자를 가진 식물체를 만들게 된다.
실험 기구 및 시약
1. 실험 재료
1) MS배지 담배의 조직배양을 위해 고안된 배지인데 고농도의 암모늄, 질산, 칼륨을 포함하고 있는게 특징이다. 이 외에도 LS배지(Linsmaier and Skoog, 1965:MS배지와 비슷하나 일부 유기물의 조성에 차이가 있다), White’s 배지(White, 1963:토마토의 뿌리배양을 위해 고안된 배지), Gamborg’s B5배지 (Gamborg et al., 1968: 캘러스 배양을 위해 고안된 배지), Schenk and Hidebrandt(1972) 배지, 약배양을 위해 고안된 Nitsch(1969)배지 등 목적에따라 여러가지 배양 배지들이 개발 되어 있다. 식물조직에서 캘러스를 유도할 경우에는 각종 배지를 모두 시험하기 보다는 2-3종의 배지 에 생장조절제의 농도 및 조합을 다르게 한 시험이 더 효과적일 때가 많다.
2) 생장조절제(오옥신, 사이토키닌)는 줄기와 뿌리의 분화 및 세포의 생장에 필수적인 요소로 식물조직 배양에 가장 중요한 요소이다. 오옥신으로는 2,4-D, NAA, IAA가 많이 사용되며 사이토카이닌의 경우는 kinetin, BA, zeatin, 2-ip, 그리고 TDZ등이 많이 사용 된다. 오옥신과 사이토카이닌을 단독 또는 조합처리해 사용한다.
3) 한천, Gelrite(15g), Agarose, Autoclave, Clean Bench, tall fescue 종자
실험 방법
1. 실험 과정
1) Clean Bench 안에서 Tall fescue종자를 핀셋을 이용하여 영양배지 샤렛에 옮긴 후 2주간 암상태 로 보관한다.
2) YEP배지로부터 이쑤시개로 single colony를 묻힌 후 3ml YEP broth에 넣는다. (미리 배양시킨 colony)
3) incubator에서 12~14시간 배양시킨다.
4) 배양시킨 3ml YEP broth에서 1ml와 추가로 40ml를 삼각플라스크에 넣고 incubator에 넣는다
5) 4~5시간 후에 흡광도를 측정한다.
6) 배양시킨 40ml culture를 원심분리기를 통해 3500rpm으로 20분간 원심분리 한다.
7) 위에 액체를 버린 후, 감염배지 40ml 를 넣고 섞는다.
8) 감염배지에 callus를 넣고 호일로 봉쇄한다.
9) 진공관에서 진공시킨다.
10) 28도에서 30분간 shaking시킨다.
11) 세균필터종이에서 1시간동안 callus를 건조시킨다.
12) co-culture plate로 이동시킨 후 밀봉한다.
13) 25도로 3일동안 암상태로 보관한다.
14) 형질전환이 되었는지 확인한다.
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