분자생물학실험 | 형질전환 유전 물질의 추출 및 확인 - Transformation, Plasmid Preparation, Enzyme Digestion

 

 

 

TIP

 

 

1. 박테리아의 유전형질을 plasmid를 이용한 유전자도입 방법으로 전환시키고 형질전환된 박테리아를 선택하는 과정 등을 이해한다.
2. 유전물질을 추출해내는 방법에 대하여 알아본다.
3. 유전물질을 확인하고 이에 대해 알아본다.

 

 

 

Transformation과 Transfection의 차이점

Transformation은 DNA를 bacterial cell에 넣는 과정으로 이를 통해 host cell의 형질전환을 일으키는 것을 뜻한다. 여기서 bacterial cell이란 E.coli와 같은 원핵세포를 말한다. 주입한 DNA가 들어있는 plasmid를 열이나 전기를 통해 cell안으로 주입시킨다. 반면, Transfection은 DNA를 진핵세포에 직접 넣어주는 것으로 형질 주입이라 한다. 형질전환과 감염이 합성된 말로 plasmid가 이용되지 않는 형질전환, 즉 phage를 이용한 것을 말한다.

 

 

pLITMUS28

소형사이즈의 플라스미드이다. (<3kb), LITMUS sequencing primer뿐만 아니라 pUC / M13 시퀀싱 프라이머와도 호환 가능하다. 다용도 클로닝 / 시험 관내 전사 파지 메이트 벡터이다. Litmus 28i를 정제하기 위해 표준 정제 과정에 의해 E.coli ER2738으로부터 분리된다. Litmus 28i는 NEB의 HiScribe RNAi Transcription Kit를 사용하여 이중 가닥 RNA의 효율적인 전사를 위해 설계되었다.

 

 

실험 방법

1. 형질전환(transformation)

① 준비된 competent cell을 얼음에서 녹인다.

 

② DNA가 들어있는 tube에 CP cell을 50㎕ 넣고, tapping하여 섞어준다.

 

③ CP cell을 ice에서 20분 동안 incubation.

 

④ Heat block에서 42℃에서 30초 동안 heat shock.

 

⑤ Ice에서 다시 2분간 incubation.

 

⑥ 액체 LB (-amp) 배지 500㎕를 넣고 37 ℃, shaking incubator에서 40분 regeneration.

 

⑦ Spin down 후 sup 버리기 (8000rpm, 3분)

 

⑧ 남은 LB로 pellet을 pipetting (천천히)

 

⑨ LB(+amp) 배지에 spreading. 37℃ O/N incubation

 

2. 유전물질의 추출 (plasmid preparation)

① 5㎡㎖의 배양액에 single colony를 picking하여 37℃에서 O/N 배양한다.

 

② 배양액을 ep tube에 옮긴 후 (1㎡㎖), centrifuge 12,000rpm 1min. : 상층액을 버린 후, 3번 반복한다.

 

③ 차가운 SolⅠ을 200㎕넣고, vortex하여 침전물을 완전히 현탁 한다.

 

④ SolⅡ를 200㎕ 넣고, tube를 10회 정도 inverting하여 섞어 준다. RT에서 5분 incubation한다. (vortex 절대 안됨. Incubation time 5분 이상 안 됨.)

 

⑤ 차가운 SolⅢ을 300㎕넣고, 바로 10회 inverting하여 섞어준 후 ice에서 5분 incubation.

 

⑥ Centrifuge 12,000rpm 10min.

 

⑦ 상층액을 조심스럽게 새로운 ep tube로 옮긴다. : 침전물을 건드리지 않도록 주의.

 

⑧ 상층액의 2배 volume의 95% ethanol을 넣어 섞어주고 얼음에서 2분 incubation.

 

⑨ Centrifuge 12,000rpm 5min.

 

⑩ 상층액을 조심스럽게 쏟아버리고, 상온에서 침전물을 건조시킨다.

 

⑪ 건조된 침전물에 차가운 70% ethanol을 1㎡㎖ 넣고, centrifuge 12,000rpm 1분.

 

⑫ 상층액을 조심스럽게 쏟아버리고, 침전물을 건조시킨다.

 

⑬ 건조된 침전물에 TE buffer(또는 T.D.W)를 20㎕ 넣어 녹인다.

 

3. 유전물질의 확인 (Enzyme digestion)

① Mix the each reagent.

 

DNA(400ng)	2㎕
10× buffer	1㎕
Kpn I	0.5㎕
T.D.W.	6.5㎕
Total	10㎕

 

② 37℃, 30 min, incubation.

 

③ Agarose gel electrophoresis로 확인.

 

 

 

[분자생물학실험]형질전환 유전 물질의 추출 및 확인 레포트