분자생물학실험 | E.coli 에서의 GFP발현 유도

 

 

 

TIP

 

 

원하는 유전자(GFP)를 plasmid를 이용하여 bacteria에서 발현시켜 볼 수 있다.

 

 

 

GFP(Green Fluorescent Protein)

Bioluminescent jellyfish (해파리) Aequorea victoria는 특징적인 초록 형광을 낸다. 이것은 칼슘-결합 광단백질 (calcium-binding photoprotein)과 green fluorescent protein (GFP)의 두 단백질에 의한 것이다. 최근 10년 동안 GFP는 생화학과 분자 생물학 분야에서 가장 흥미로운 단백질의 하나로 여겨져 왔다.

 

GFP는 발광하는 특성 때문에 정량적인 측정이 쉬워서 박테리아에서 형체 전이 마우스에 이르기까지 광범위한 생명체내에서 우리가 연구하고자 하는 유전자가 언제 어디서 얼마나 많이 발현되고 소멸되는지 알아볼 수 있는 표지로서 이용되어 왔다. Shimomura 연구 그룹에 의해 1962년에 발견된 GFP는 2.6kb 크기의 세 개의 exon으로 구성된 238-residue polypeptide이다. 이 단백질은 열이나, 극한의 pH, 화학적 변성제 등의 거친 자극 하에서도 그 활성을 잃지 않으며, formaldehyde로 고정된 후에도 계속적으로 형광을 발한다. 하지만 환원 조건 하에서는 빠른 속도로 형광 활성이 상실된다.

 

 

실험 방법

1. plasmid DNA isolation

① centrifugation 10min

② supernatant remove

③ pellet 100㎕ ice cold alkaline lysis solutionⅠ으로 resuspention

④ 200㎕의 solutionⅡ add → inverty the tube Don't vortex → store in ice(cell이 투명해질 때까지 4～5min) → 색깔이 투명해짐

⑤ 150㎕의 solution Ⅲ add → inverty tube several time → ice에 3～5min store → 흰색침전생성

⑥ centrifugation 15min → supernatant를 fresh tube에 옮김

⑦ phenol 1:1로 inverty후 3min → centrifugation 5min → 윗층따서 fresh tube에 옮김

⑧ chloroform 1:1 분주 → inverty 5min후 centrifugation

⑨ supernatant에 2vol의 70% EtOH를 R.T(상온)에서 add

⑩ -70˚C에서 20min 보관

⑪ 4˚C 20min centrifugation

⑫ supernatant remove

⑬ EtOH 제거 drying(30min)

⑭ D.W 20㎕를 넣어 elution

⑮ Electrophoresis

 

2. GFP gene PCR & DNA electrophoresis

1) PCR(Polymerase Chain Reaction)

Step : Denaturation → Annealing → Polymerization → 4˚C ∞

 

3. Electro-elution & DNA electrophoresis

1) PCR Product Elution

① PCR Product electrophoresis

② Elution

③ PCR Product 확인(by electrophoresis)

 

2) Gel Dissociation

① PCR Product를 전기영동한 후 PCR Product가 위치하는 부분의 Gel을 잘라낸다.

② Gel을 EP tube에 넣은 후, DF buffer 500㎕를 넣어주고 mix한다.(by vortexing)

③ 55˚C heating block에서 10～15min 동안 incubation.(Gel이 완전히 녹을 때 까지)

④ dissolved sample mixture를 RT로 cool down

 

3) DNA binding

⑤ DF column를 2㎖ collection tube에 넣는다.

⑥ sample mixture를 DF column에 Apply한다.

⑦ centrifugation 30sec

⑧ collection tube에 있는 soap 제거

 

4) Wash

⑨ DF column에 600㎕의 wash buffer add.

⑩ centrifugation 30sec

⑪ collection tube에 있는 soap 제거

⑫ centrifugation 3min

 

5) DNA Elution

⑬ DF column을 새 EP tube로 옮긴다.

⑭ Elution buffer를 10～30㎕ column matrix 중앙에 add.

⑮ 2min간 strand(matrix에 Elution buffer가 스미도록)

⑯ centrifugation 2min

 

4. Ligation & Transformation

1) Ligation : 22℃ for 15min

 

2) Transformation into E.coli(Top 10F')

① Competent cell을 ice에서 녹인다.

② Ligation mixture에 Cp cell을 Add

③ Pipetting 2～3회

④ Ice에 15min

⑤ 42℃ Heat shock for 1min 30sec

⑥ LB 1㎖ Add

⑦ shaking for 1hr

⑧ Ap plate에 loading

 

5. Tooth picking & Cracking

① Cracking Buffer : 40㎕ + phenol : chloroform 16㎕

② plate에서 Loop으로 colony를 딴다. 그리고 tube에 하나씩 넣어준 뒤, vortexing 10～15초

③ centrifuge 3min

④ gel running

 

6. Plasmid isolation (mini-prep kit)

① Harvesting cell(by centrifuge)

② PD1 buffer 200㎕로 resuspension(by vortexing or pipetting)

③ PD2 buffer 200㎕ add. Inverting 10 times

④ stands for 2min at room temperature

⑤ PD2 buffer 300㎕ add. Inverting 10 times (do not vortexing)

⑥ centrifugation 3min at full speed

⑦ Place a PD column in 2㎖ collection tube

⑧ Disscard the flow through & Place a PD column back into 2㎖ collection tube

⑨ Add 400㎕ of W1 buffer

⑩ centrifugation for 30sec

⑪ 600㎕ wash buffer add

⑫ centrifugation for 30sec

⑬ Disscard the flow through & Place a PD column back into 2㎖ collection tube

⑭ centrifugation for 3min

⑮ Transfer dried PD column to Ep tube

⑯ Add 50㎕ of elution buffer

⑰ 2min at room temperature

⑱ centrifugation for 2min

 

7. Enzyme cutting & Plasmid orientation check

 

 

 

[분자생물학실험]E.coli 에서의 GFP발현 유도 레포트