미생물학실험 | Simple staining, Gram staining

 

 

 

Simple staining(단일염색)

세균을 슬라이드 글라스에 고정한 후, 한가지 염색액으로 염색해서 세균의 형태, 배열, 크기 등을 신속히 관찰하는 방법을 단순염색이라고 하며, methylene blue, carbol fuchsin, crystal violet, safranin 등의 염기성 염료(basic dye)를 주로 사용한다. 염기성 염료는 양전하를 띠기 때문에, 음전하를 띠는 핵산을 많이 가지고 있는 ribosome이 많은 원형질 부분이나 세포벽이 많은 부분을 염색한다.

 

다음에 실험할 그람 양성균이나 그람 음성균 모두 세포막이 있으므로, 이론적인 시료의 색이 나오는것이 정상이다. 가장 중요한 것은 열고정을 해야 한다는 것인데, 열고정 방법은 건조될 도말 부위가 위로 향하도록 하여 알코올램프 불꽃의 2/3높이로 1초 정도 3～4회 통과시켜 고정시킨다. 이 열고정은 박테리아를 죽이고, 슬라이드 글라스 쪽으로 붙이고, 염색액 흡수를 도와준다. 하지만 이 과정은 관찰하려는 균을 수축시켜버리거나 뒤틀리게 해서 변형될 우려가 있으므로 조심해야 한다.

 

 

실험 방법

1. Simple staining

① 먼저 백금이를 알코올 램프로 살균한 뒤 균주를 살짝 묻혀서 슬라이드 글라스에 물과 함께 도말한다. (균이 적을수록 결과가 잘나온다).

 

② 슬라이드 글라스를 알코올 램프 위를 왔다갔다 하여 열고정한다.(액체가 다 증발할 때 까지 지속한다). 단, 균이 타지 않도록 주의한다.

 

③ 열고정이 완료되면 Methylene Blue용액과 Safranin 용액을 떨어 뜨리고 1분간 기다린다.

 

④ 1분 뒤 염색액을 세척한다.

 

⑤ 세척 후에 물기를 잘 제거한다.

 

⑥ 그 뒤 현미경을 이용하여 슬라이드 글라스를 관찰한다.

 

2. Gram staining

① 먼저 백금이를 알코올 램프로 살균한 뒤 균주를 살짝 묻혀서 슬라이드 글라스에 물과 함께 도말한다(균이 적을수록 결과가 잘나온다).

 

② 슬라이드 글라스를 알코올 램프 위를 왔다갔다 하여 열고정한다.(액체가 다 증발할 때 까지 지속한다). 단, 균이 타지 않도록 주의한다.

 

③ 열고정이 완료되면 Methylene Blue 용액을 떨어 뜨리고 1분간 기다린다.

 

④ 1분 뒤 1차 염색액을 세척한다.

 

⑤ 다음에는 Lugol soln을 떨어 뜨려 1분간 기다린다.( 는 인체에 매우 해로우므로 조심하여 다룬다.)

 

⑥ 매염제는 1차염색액과 복합체를 형성해 강한 결합을 일으킨다.

 

⑦ 1분 뒤 Lugol soln 이 떨어진 부분을 세척한다.

 

⑧ 다음과정으로 95% EtOH을 떨어 뜨린후 15초 대기한다.(너무 오랫동안 탈색하지 않는다.)

 

⑨ 탈색액으로 인해 1차 염색액이 탈색된다.

 

⑩ 세척 후에 2차 염색액인 Safranin을 떨어 뜨리고 2～30초 대기한다.

 

⑪ 세척 후에 물기를 잘 제거한다. 그 뒤 현미경을 이용하여 슬라이드 글라스를 관찰한다.

 

 

 

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