생화학실험 | 질소원에 따른 미생물의 성장

 

 

 

TIP

 

 

1. 분해 균주 실제공정 시스템에 넣기 위해 균주의 특성을 조사한다. 
2. 균주(1082, 1153)에 서로 다른 질소원 조건을 주었을때 미생물의 성장을 알아본다.

 

 

 

미생물의 생육곡선(growth curve)

생육곡선은 생물의 생장 현상을 나타낸 곡선. 생물의 개체나 기관의 생장량 또는 군집(집단)의 생장량을 시간의 경과에 따라 생장곡선은 S자모양의 시그모이드 곡선(식물 생장에서는 로지스틱곡선 또는 자기촉매반응곡선이라고도 한다)이며, 세균의 증식 등은 이와 같은 생장곡선을 나타낸다. 시그모이드형의 생장은 처음에는 완만하게 증가하는 생장의 상이 있고, 이어서 급속하게 생장하는 상을 거쳐 마지막에는 서서히 생장이 저하하여 정지하게 되는 3가지 상으로 되어 있다. 미생물을 액체배지에 배양할 때 배양시간과 생균수의 대수 사이의 관계를 나타내는 곡선.

 

 

1. 유도기(lag phase, induction phase)

균을 새로운 배지에 접종하여 배양할때 배지에 적응하는 시기로 세포가 새로운 환경에서 증식하는데 필요한 각종 효소단백질을 생합성하는 시기 분열을 위해 세포의 크기가 커지고 호흡활성도가 높은 시기입니다. 세포내의 RNA량은 현저하게 증가하고 효소단백질 합성이 왕성한 시기(DNA량은 변화하지 않음)

① 생균수 > 사균수

② 영양성분이 많고

③ 증식에 용이한 환경

 

2. 증식기, 로그대수기(logarithmic phase, exponential phase)

세포가 대수적으로 증식하는 시기로 세대시간, 세포의 크기가 일정한 시기 세포질의 합성속도와 세포수의 증가는 비례 증식속도는 배지의 영양, pH, 온도, 산소분압 등의 환경 인자에 의해서 결정 세포의 생리적 활성이 가장 강한 시기이며 물리적, 화학적 처리에 대해서 감수성이 높은 시기입니다.

① 생균수 > 사균수

② 영양성분 서서히 감소

③ 환경이 서서히 열악해짐

 

3. 안정기, 정상기(stationary phase, maximum phase)

생균수는 일정하게 유지되고 총균수는 최대가 되는 시기 일부 세포가 사멸하고 다른 일부의 세포는 증식하여 사멸수와 증식수가 거의 같고 영양물질의 고갈, 대사생산물의 축적, 배지 pH의 변화, 산소공급의 부족 등 부적당한 환경이 되어 생균수가 증가하지 않으며 내생포자를 형성하는 세균은 이식에 포자를 형성합니다.

① 생균수 = 사균수

② 영양성분 고갈

③ 내성포자균은 포자형성

 

4. 사멸기(death phase, phase of decline)

생균수가 감소하는 시기로 영양분 고갈과 미생물의 대사노폐물로 인해 생육에 최고로 열악한 환경으로 영양분이 없어진 미생물은 영양분을 얻기 위해 자기 몸의 성분을 각종 가수분해 효소를 이용해 분해하여 영양분으로 사용하는 시기로 자가소화가 일어나는 시기입니다. 그리고 다른 미생물을 죽이기 위해 독소를 만드는 시기이기도 합니다. 자가소화(autolysis)가 어느 정도 진행되며 세포가 용해되고 사멸하게 됩니다.

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실험 방법

1. 배지만들기

1) 깨끗한 메스실린더 1000㎖에 증류수를 1000㎖를 2개 준비한다.

 

2) 메스실린더 1000㎖ 증류수를 1000㎖ 비커에 500m씩 넣는다. 500㎖만 넣은 이유는 교반시 용액이 다른 곳으로 튈 수 있기 때문이다.

 

3) 교반기 위 2개의 비커에 전자저울에 무게를 재어 비커에 시약을 넣는다. 순으로 넣고, 은박지를 꼼꼼히 싸서 완전히 교반을 시킨다. 교반 시 시약은 한 개 넣은 후 다 녹으면 다른 시약을 무게를 재어서 넣는다. 빨리 넣게 되면 미세한 덩어리들이 생길 수가 있다.

 

4) 액체배지를 만들기 위해 250㎖의 삼각플라스크에 10개를 약100㎖를 잘 분배 하여 넣는다. 그리고 질소원(안 넣은 것, yeast, peptone, triptone, beef exfract을 2개씩 0.5g을 넣어준다. 그 전에 미리 이름표를 붙여둔다. 은박지를 2중으로 꼼꼼히 싸서 Autoclave에 넣고 121℃에서 15분 가량을 돌려 멸균을 시킨다.

 

 

5) 또 하나 준비해둔 배지에 고체배지를 만들기 위해서 yeast 2.0g을 넣어 교반 시킨 뒤 5개의 삼각플라스크에 200㎖로 나누어 담는다. 다섯 개의 삼각플라스크중 2개는 1153균을 넣기위하여 pH5.5, 3개는 1082균을 넣기 위해 pH7를 맞추어준다.

 

6) 각 5개의 삼각플라스크에 Agar를 3.3g을 넣어준다. 은박지를 2중으로 꼼꼼히 싸서 Autoclave에 넣고 121℃에서 15분 가량을 돌려 멸균을 시킨다.

 

2. 흡광도 측정 방법

1) UV-Vis 기계로 가져가서 갑을 측정한다. 측정할 때에는 먼저 셀에 증류수를 넣어 영점을 맞춘다. 다음 미생물을 셀에 넣고 측정을 해준다. 이때 셀의 수는 한정되어 있기 때문에 한번 쓴 셀은 증류수로 깨끗하게 씻어 말린후, 물기가 최대한 적은 상태에서 다른 미생물로 측정해준다. 물기가 남아있다면 농도의 차이가 있으므로 미세하게 틀려지기 때문이다. UV-Vis 기계가 아주 민감한 기계이므로 흔들림이나 셀의 지문 등을 깨끗하게 해주어야한다.

 

2) 만든배지에 균주1082, 1153을 각 삼각플라스크에 1㎖씩 넣어주고 3시간에 한번씩 흑광도를 측정해서 질소원에 따라 각 균주의 성장을 알아본다.

 

3. 도말하는 방법

 

 

먼저 시료액을 배지위에 떨어뜨린 후에 유리막대봉으로 문질러 줍니다. 사용하기 전 유리 막대봉은 70%에틸알콜에 담가두었다가 화염멸균후 사용합니다. 무지를 때 주의해야 할 사항은 너무 세게 도말하면 배지가 찢어질 수도 있습니다. 골고루 도말해야 합니다. 도말시에는 나머지 한손으로 배지를 돌려가며 도말합니다.

 

4. 스크래치하는 방법

백금이를 먼저 화염멸균을 합니다. 백금이를 식힌후(식었는지 확인하려면 배지에 살짝 대보면 압니다. 아직 뜨겁다면 배지에 자국이 남게됩니다.) 균주를 백금이로 채취한 다음 패트리디쉬에 스크래치 합니다.

 

 

Streaking시 주의할 사항은 너무 많은 균을 접종해선 안되며 1차도말에서 다음 단계 도말로 넘아갈 시에 새로운 균을 채취하는 것이 아니라 기존의 배지에 묻어있는 균을 퍼뜨려 도말하는 것입니다. 도말의 목적은 고체배지 상에서 싱글콜로니를 얻는 것입니다. 1차도말에서는 도말간격을 촘촘히 하고 단계가 진행될 수록 간격을 넓혀 싱글콜로니를 얻도록 해줍니다. 간격이 좁으면 콜로니간 뭉치게 됩니다.

 

 

그림처럼 1차에서 자란 콜로니는 간격이 매우 좁아 싱글콜로니를 볼 수 없고 각 다음단계로 갈 수록 균의 밀집도는 넓어져서 싱글콜로니가 나타나게 되는 것입니다.

 

 

 

[생화학실험] 질소원에 따른 미생물의 성장 레포트