분자생물학실험 | Animal Cell Culture, Cell lysis, and Protein Quantification

 

 

 

실험기본장치들에 대한 이해, 세포배양, 그리고 gene과 관련한 실험을 진행해본 경험을 토대로, 특정 gene을 E.coli에 translation시켜, target gene을 복제함을 배웠다. 이 gene을 2가지 실험 방법으로 활용할 수 있음을 알 수 있다.

 

첫번째로는, gene 자체로만 활용하는 것이다. 그것이 바로, plasmid DNA Isolation이다.

두번째로는, gene에 의해 발현된 protein을 활용하는 것이다.

 

본 실험은 이와 연관된 protein isolation을 다룬다. 그리고, 추가적으로 standard curve를 이용하여 protein의 농도를 측정하는 방법도 배울 것이다.

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) Plate위에 있는 cell에 RIPA buffer을 p200 pippet을 이용하여 100㎕ 떨어뜨린다.

 

2) RIPA buffer가 cell에 골고루 작용하도록 scrapper로 RIPA buffer을 plate에 전체적으로 펴준다.

 

3) Plate를 기울이고 scrapper를 활용해, 용액을 한쪽으로 몬다.

 

4) 몰린 용액을 pippet으로 따내서 e-tube에 넣는다.

 

5) e-tube를 ice에서 20분간 놔둔다.

 

6) 4° 15,000rpm에서 20분간 centrifuge를 한다.

 

7) 기다리는 동안 Bradford assay를 하기 위해, 새로운 e-tube에 399㎕의 3° DW, 100㎕의 Bradford solution(5x)를 넣어서 protein solution 1㎕을 넣었을 때, 500㎕가 되도록 한다.

 

8) Centrifugation이 끝난 후, supernatant를 새로운 e-tube에 옮긴다. (이 supernatant는 cell lysate라고 불린다.)

 

9) Bradford solution안에 있던 물질들이 가라앉을 수 있기 때문에, vortexing한다.

 

10) e-tube에 담긴 supernatant를 1㎕따서 Bradford solution이 담긴 e-tube에 넣는다.

 

11) Supernatant와 Bradford solution이 잘 섞이도록 vortexing한다.

 

12) 최종적으로 e-tube에서 200㎕씩 두 번을 따서, spectrophotometer를 하는 용기에 각각 담는다.

 

13) Spectrophotometer가 끝나고, standard curve으로부터 해당되는 595㎚의 흡광도에서 protein solution의 농도를 구한다.

 

14) 구한 protein solution 농도를 바탕으로, 100㎕의 solution을 만든다. (protein의 양은 100㎍이 되도록 하고, 5X SDS는 전체 부피 의 1/5 (20㎕)를 넣고, 마지막으로 RIPA solution은 전체 용액의 부피가 100㎕가 될 정도로 넣는다.)

 

 

 

[분자생물학실험]Animal Cell Culture, Cell lysis, and Protein Quantification 레포트