일반생물학실험 | LB배지 만들기 및 Colony dilution

 

 

 

TIP

 

 

Acid phosphatase 이용한 효소반응을 통해 Michaelis-Menten equation, Lineweaver-Burk를 이해할 수 있다.

 

 

 

배지의 종류

자연계에 존재하는 세균은 필요한 영양분을 균체 주위 환경에서 흡수하지만, 임상 검체에서 병원균을 분리하거나 연구목적으로 실험실내에서 목적하는 세균을 증식시키고자 할 때에는 그 세균이 증식가능한 배지를 만들어 적당한 환경에서 배양하여야 한다. 세균 영양은 기본적으로는 동일하지만 종류에 따라서는 다른 영양성분을 요구하는 경우가 있다.

 

매우 간단한 배지 즉 질적으로나 양적으로 성분이 확실한 합성배지에서 증식할 수 있는 것부터 육즙, 펩톤 등 복잡한 성분이 포함된 완전배지, 복합배지, 영양강화배지가 아니면 증식할 수 없는 것도 있다. 배지는 그 형상도 중요하지만, 목적하는 균이 필요로 하는 모든 영양분, 발육인자, 무기이온 등을 함유하고 적당한 삼투압, 수소이온농도, 산화환원전위를 표시하지 않으면 안된다. 배지에는 그 형상, 조성, 목적 등에 따라 분류할 수 있다.

 

분류 기준	종류
화학적 조성	성분명확(합성)배지, 복합배지
물리적 성질	액체배지, 반고체배지, 고체배지
기능	지지(일반적인 목적)배지, 농화배지, 선택배지, 분별배지

 

 

실험 방법

1. 배지 만들기

1) DW 600㎖ + LB15g(N:T:Y=2:2:1)+ agar 9g을 준비한다.

 

2) 삼각플라스크에 넣고 magnetic stirrer넣고 hot plate에서 녹인다.

 

3) 잘 녹인후 auto clave 돌린다.

 

4) 은근한 열이 있을 때까지 식힌다. (굳지 않게 유의)

 

5) petri-dish에 적당한 양을 부어주고 식혀 굳힌다.

 

6) 랩(or 파라필름테이프)에 싸서 4°에 거꾸로 보관한다.

 

2. colony dilution

1) round-bottom tube에 LB 3㎖을 넣고 single colony(DH5α)를 섞어준다.

 

2) shaking incubaton에 250rpm에 37℃ 15시간 돌려준다.

 

3) 1.5㎖ tube에 DH5α 200㎕를 넣는다.

 

4) 7개의 1.5㎖ tube에 LB 180㎕를 넣는다.

 

5) 1/10으로 dilution해가면서 넣는다.

 

6) 살짝 vortexing한다.

 

7) 만든 배지를 거꾸로 놓고 네임펜으로 칸을 나눈다.

 

8) 각각 맞는 칸에 10㎕씩 분주한다.

 

9) 37℃ incubator에 O/N 배양한다.

 

10) 다음날 colony를 관찰한다.

 

3. 참고 : 기본적인 배지 제조방법

1) 배지성분을 칭량(저울을 달기)한다.

 

2) 물에 용해시킨다(한천이 존재할 경우 끓여 녹인다)

 

3) pH를 조정한다.

 

4) 적당한 용기에 분주한다(병, 플라스크, 시험관 등)

 

5) 고압습열멸균을 통해 멸균하거나(중성배지의 경우 121°C에서 15분간, 산성배지는 115°C에서 10분간 실시한다), 일부 선택배지의 경우에는 끓인다.

 

 

 

[일반생물학실험]LB배지 만들기 및 Colony dilution 레포트