생화학실험 | Enzyme Kinetics

 

 

 

TIP

 

 

Acid phosphatase 이용한 효소반응을 통해 Michaelis-Menten equation, Lineweaver-Burk를 이해할 수 있다

 

 

 

Inhibitor

많은 효소들의 활성은 특수한 작은 분자들과 이온들의 결합에 의해서 억제될 수 있다. 효소 활성을 억제하는 이 수단은 생체에서 주요한 조종기구의 역할을 하며, 다른 자리입체성 효소들의 조절이 이 유형의 조종의 전형적인 예가 된다. 효소를 실활시키지 않으면서 반응속도를 저하시키는 물질을 저해제라고 한다. 즉, 반응 억제제로써, 특정 효소의 반응을 억제하는 역할을 담당한다. 그래서 효소의 결합을 막고 결과적으로 Inhibitor가 효소에 결합함으로써 효소, 기질의 촉매작용을 방해하게 된다.

 

1. Irreversible Inhibitor(비가역적 저해제)

공유결합으로 또는 비공유결합으로 매우 단단하게 효소에 결합하기 때문에 표적 효소로부터 매우 천천히 해리한다. 대개 효소에 작용하여 화학적인 변화를 야기한다. 효소 활성에 꼭 필요한 효소의 아미노산 부위를 변형시킴으로써 본래의 기능을 상실하게 만드는 것이다.

 

2. Reversible Inhibitor(가역적 저해제)

효소-억제물 복합체의 해리가 빠르다. 그래서 효소에 결합하여 기질과의 결합을 물리적으로 방해하거나, 효소-기질 복합체(complex)와 결합하여 효소의 작용을 방해한다.

 

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실험 방법

실험 1

1) 6개 tube를 준비한다.

 

2) pipet을 이용하여 1.0M sodium acetate buffer를 각 tube에 0.1㎖씩 넣는다.

 

3) pipet을 이용하여 0.1M MgCl₂ 0.1㎖을 각 tube에 넣는다.

 

4) 기질(pNPP)과 물을 아래의 표만큼 각 tube에 넣는다.

 

Reagent	1	2	3	4	5	6
4.8×10-4 M pNPP(㎖)	0.1
2.4×10-3 M pNPP(㎖)		0.1		0.5
4.8×10-3 M pNPP(㎖)			0.1		0.5
4.8×10-2 M pNPP(㎖)						0.1
H2O (㎖)	0.8	0.8	0.8	0.4	0.4	0.8
pNPP conc. (mM)	0.040	0.20	0.40	1.00	2.00	4.00

 

 

5) acid phosphatase solution 0.1㎖씩을 1번 tube에 넣음과 동시에 시간을 잰다.

 

6) 1분간격으로 다음 tube에 acid phosphatase solution 0.1㎖씩 넣는다

 

7) acid phosphatase solution 넣은 후 15분이 되었을 때, 0.5M KOH 4㎖를 넣어서 효소반응을 중지시킨다.

 

8) 7)을 각 tube마다 실행한다.

 

9) 각 tube에 있는 용액을 분광광도계를 이용하여 405㎚에서의 흡광도를 측정한다.

 

10) 측정하여 나온 흡광도를 이용하여 A=εbc[램버트 비어(Lambert-Beer)]에 적용하면 반응물:[PNP]의 농도를 구할 수 있다.

 

11) Michaelis-Menten 그래프와 Lineweaver-Burk 그래프를 그릴 수 있다.

 

 

실험 2 : 저해제 첨가

1) 첫 번째 실험은 실험1과 동일 ⇒ 흡광도 측정

 

2) 두 번째 실험 : 저해제 첨가 ⇒ 흡광도 측정

①～③동일

④ 기질(pNPP)양은 동일

 

Reagent	1	2	3	4	5	6
H2O(㎖)	0.6	0.6	0.6	0.2	0.2	0.6
Na2HPO4(㎖)(저해제)	0.2

 

⑤～⑪ 동일

 

 

실험 3 : 경쟁적, 비경쟁적 저해제 2개 첨가

1) 첫 번째 실험은 실험1과 동일 ⇒ 흡광도 측정

 

2) 두 번째 실험 : 미지(경쟁적 or 비경쟁적) 저해제 첨가 ⇒ 흡광도 측정

④만 변경 나머지 동일

 

Reagent	1	2	3	4	5	6
H2O(㎖)	0.6	0.6	0.6	0.2	0.2	0.6
저해제①(㎖)	0.2

 

3) 세 번째 실험 : 나머지 저해제 첨가 ⇒ 흡광도 측정

④만 변경 나머지 동일

 

Reagent	1	2	3	4	5	6
H2O (㎖)	0.6	0.6	0.6	0.2	0.2	0.6
저해제②(㎖)	60.2

 

 

 

[생화학실험] Enzyme Kinetics 레포트