일반생물학실험 | Agarose gel 만들기 및 DNA electrophoresis

 

 

 

TIP

 

 

1. 전기영동의 의미를 이해하고 DNA의 크기 및 구조에 따른 결과차이를 이해한다.
2. Agarose gel에 DNA와 loading dye를 넣고 전기를 걸어주면 DNA는 인산기 때문에 매질을 타고 양전하 방향으로 움직이게 된다. 이때 움직이는 속도는 DNA의 크기에 다라 다르므로 매질 내에서 종류에 따라 분리하게 되며 전기영동은 DNA의 크기에 따른 분리를 한다.

 

 

 

DNA 전기영동의 원리와 특성

DNA 분자 연구를 위해 겔 전기영동(gel electrophoresis)이 많이 사용된다. 이 기술에서는 겔을 사용하는데, 겔은 크기, 전하량, 기타 물리적 성질에 기초하여 핵산이나 단백질을 분리한다. 핵산은 인산기에 의해 음전하를 띠기 때문에, 전기장 내에서 양극으로 이동한다. 핵산이 전기장 속에서 겔 섬유질 복합체를 통과하여 양극으로 이동할 때, 긴 길이의 핵산은 짧은 길이의 핵산보다 많은 저항을 받게 되어 이동 속도가 느려지게 되고, 결국 핵산은 그 길이에 따라 분리된다. 따라서 선형 DNA 분자의 혼합물은 겔 전기영동에 의해 같은 길이의 DNA 분자로 구성된 밴드로 분리된다.

 

겔 전기영동(gel electrophoresis)
	DNA 시료들을 얇은 판 형태의 겔 상단에 위치한 각각의 홈에 넣는다. 유리판에 의해 고정된 겔을 용액 속에 넣은 후 양 끝에 전극을 부착한다.
	전류가 흐르기 시작하면 음전하를 띠는 DNA 분자는 그 크기에 따라 이동(크기가 작을수록 빠르게 양전극으로 이동) 밴드는 DNA에 결합하는 염색약을 첨가하기 전까지는 눈에 보이지 않는다.(염색약을 첨가 시 전류 차단할 것)

 

대부분의 경우 PCR 실험의 결과는 아가로즈 젤에 증폭된 반응액의 일부를 전기영동 하여 확인할 수 있다. 증폭된 DNA를 나타내는 밴드는 ethidium bromide(EtBr)로 염색하여 관찰할 수 있지만 DNA의 양이 적은 경우에는 Southern hybridization으로 확인할 수 있다. 만약 기대되는 밴드가 관찰되지 않거나 부가적인 밴드가 존재하면 재실험이 수행되어야 한다.

 

전기영동은 겔 사이로 전류를 흘려보내 대전된 분자들을 움직이게 한다. 이후 염료로 겔을 처리하여 단백질을 염색시킨다. 가장 간단한 경우에는 겔 위에 한 개의 띠가 형성된다. 이 경우는 단백질이 동종(보통 동형접합자의 산물)이다. 단백질이 이종(보통 이형접합자의 산물)이면 겔 위에 두 개의 띠가 형성된다. 이것은 두 대립유전자의 단백질들이 한 개의 아미노산 차이로 다르기 때문이다. 각 단백질은 다른 전하를 가지고 있고, 때문에 다른 속도로 겔 사이를 움직인다. 대립효소(allozyme)라는 용어는 같은 유전자에 있는 대립유전자에 의해 조절되는 효소의 다른 전기영동 형태들을 말한다.

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실험 방법

1. Agarose gel 만들기

1) 1× TAE 용액으로 희석하여 350㎖에 3.5g을 섞어서 1%로 만든다.

 

2) 전자레인지를 사용하여 열을 가해서 완전 용해시킨다.(or magnetic bar와 steriler를 이용하여 녹인다.)

 

3) 뜨거운 것을 약간 식힌 후 틀에 부어준다.

 

4) 바를 끼워준다.

 

5) 완전하게 굳으면 틀에서 떼어내고 1× TAE 용액에 담궈 보관한다.

 

2. DNA electrophoresis

 

Amount of agarose in gel (% [w/v])	Efficient range of separation of linear DNA ㏖ecules (kb)
0.3	5-60
0.6	1-20
0.7	0.8-10
0.9	0.5-7
1.2	0.4-6
1.5	0.2-3
2.0	0.1-2

아가로오스 농도에 따른 DNA 단편의 분리범위

 

1) well의 가장 왼편에 loading dye와 DNA를 섞어서 주입한다. 몇 람다를 넣어야 할까요? (총 양은 6㎕이고 loading dye는 6X입니다)

 

2) 6X loading dye가 6㎕이면 PCR product는 30㎕, total 36㎕

 

3) 전기를 50mV-100mV를 걸어준 후 15분 정도 기다린다.

 

4) DNA를 확인한다.

 

 

 

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