식품분석학실험 | DNA extraction & qRT-PCR

 

 

 

TIP

 

 

경상도 지방 김치에서 균주를 분리하여 DNA를 추출하고, qRT PCR을 통하여 Lactobacillus와 같이 프로바이오틱스의 특성을 보이는 균주가 존재하는지를 알아본다.

 

 

 

qRT-PCR을 이용하는 이유

균수 계수를 측정하는 방법으로 cell culture 없이 균수를 측정하는 non-culture-based 방법을 더 많이 이용하는 추세이다. Non-culture-based 방법을 사용하면 배양이 되지 않아 실험실 수준에서는 관찰이 되지 않는 미생물까지 측정할 수 있기 때문이다. Non-culture-based 방법은 먼저 박테리아의 DNA를 추출하는 단계를 거처서 Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)을 사용하여 실시간으로 증폭되는 DNA를 볼 수 있다.

 

End-point PCR에서는 Poor Precision, Cross-contamination의 위험과 낮은 특이성과 민감성이라는 단점을 가지고 있고, 시간에 따른 정량적인 분석이 불가능한 반면에 qRT-PCR은 Probe-specific Fluorescence를 이용하여 더 높은 정확성과 민감성으로 정량적인 분석이 가능하다. 뿐만 아니라 기존의 PCR보다 reaction time보다 빠르고 더 넓은 범위의 DNA를 측정할 수 있는 장점을 가지고 있으며 cross-contamination의 위험이나 post-PCR 단계도 필요하지 않다.

 

 

Amplification plot

아래의 그림은 PCR의 지수적 성장기 동안의 PCR cycle number와 fluorescence signal를 축으로 한 plot이다. Baseline은 fluorescent signal 이 축적은 되고 있지만 기계가 detection 할 수 있는 한계 이하의 PCR cycle을 의미한다.

 

 

Threshold는 fluorescence가 측정될 수 있는 최소값을 말하고 threshold 값 이상을 나타내는 reporter fluorescence signal들만 Ct(threshold cycle)값으로 셀 수 있다. Ct는 threshold cycle의 수를 의미하고 Ct값이 작을수록 박테리아의 DNA가 많이 존재한다고 해석할 수 있다.

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실험 방법

Day 1 DNA Extraction

1) Sample을 각각 2㎖씩 네 개의 tube에 담는다. (4㎖씩 한 sample이 되며, duplication하기 위해 두 개의 sample을 준비한다.)

 

2) 12000g, 5min centrifuge

 

3) Pellet에 lysis buffer 600㎕ (300㎕ x 2)를 loading한다.

 

NaCl 500mM	29.22 g/㎖
EDTA 50mM	18.612 g/㎖
SDS 4%	0.04 g/㎖
Tris-HCl 50mM	7.88 g/㎖

 

4) bead beating tube에 넣고 bead beating을 5min간 실시한다.

 

5) 12000g, 5min centrifuge

 

 

6) 새로운 e-tube에 상등액과 binding buffer 200㎕, proteinase K 20㎕를 넣는다.

 

7) 60℃, 10min incubation

 

8) isopropanol을 200㎕ 넣고, pipetting한다.

 

9) sample 전부(거의 1㎖)를 Bioneer 회사의 column에 loading 후, 12000g, 1min centrifuge. 그 후 밑에 나온 것은 버리고 다시 끼운다.

 

10) Washing buffer1 500㎕ loading하고 12000g, 1min centrifuge 후, 밑에 나온 것은 버리고 다시 끼운다.

 

11) washing buffer2 500㎕ loading하고, 12000g, 1min centrifuge 후, 밑에 나온 것은 버리고 다시 끼운다.

 

12) 빈 튜브 다시 끼우고 16000g, 1min centrifuge후, collection tube에 column을 끼운다.

 

13) Elution buffer 100㎕ 넣고, RT에서 5min간 incubation후 12000g, 1min centrifuge

 

14) spectrophotometer로 확인한다. (nanodrop)

 

 

Day 2-3 qRT PCR 및 결과 확인

1) Master mix를 primer 종류별로 2가지 만든다.

 

2) Primer1: Universal bacteria

 

3) Primer2: Lactobacillus specific primer

 

Master mix의 조성	한 well 당 들어갈 양	넉넉하게 만든 master mix volume
Q Green+SyBR green Pre Mix (2X)	10㎕	100㎕
Primer(Forward + Reverse)	1㎕	10㎕
Distilled water	4㎕	40㎕

 

4) 한 well당 → master mix 15㎕ + template DNA 5㎕ = total volume 20㎕

 

5) DNA가 50ng이 들어가도록 넣어야 하므로 DNA는 10ng/㎕의 농도로 맞추면 된다. 전날 정량한 결과를 보니 약 20ng/㎕의 DNA가 나왔으므로, 우리 조는 DNA 50㎕와 DW 50㎕를 합쳐서 넉넉하게 100㎕를 만드는 것과 동시에 DNA 농도를 1/2로 희석하여 농도가 10ng/㎕가 되게끔 만들었다.

 

6) 1열로 쭉 7개의 well에 template DNA 5㎕와 Universal bacteria primer가 들어있는 master mix 15㎕를 loading한다. 맨 밑에 대조군으로 한 well에 DW 5㎕와 master mix 15㎕를 넣는다.

 

7) 1열로 쭉 7개의 well에 template DNA 5㎕와 Lactobacillus specific primer가 들어있는 master mix 15㎕를 loading한다. 맨 밑에 대조군으로 한 well에 DW 5㎕와 master mix 15㎕를 넣는다.

 

8) qRT-PCR기계에 well을 넣고 PCR을 40cycle돌리고 61.5℃에서 detection한다.

 

9) 그 다음날 결과를 확인한다.

 

 

 

[식품분석학실험]DNA extraction & qRT-PCR 레포트