1. 침에 의한 효소 작용과 그 성분을 유추할 수 있다.
2. Maltose 표준 곡선을 이용하여 침에 들어있는 효소의 양을 구할 수 있다.
표준 곡선 (standard curve, master curve, type curve)
대표적인 여러 모델에 대하여 모델 변수의 변화에 따라서 모델의 반응을 이론적으로 계산한 곡선이다. 표준 곡선은 실제 탐사 자료를 해석하고자 할 때 실제 자료와의 비교를 위해 사용되며 대체적으로 가로축과 세로축은 정규화 된 값으로 만들어진다.
아밀라아제 (amylase)
침 1ℓ 속에는 약 0.4g의 아밀라아제가 들어 있는데, 침이나 위액 속의 아밀라아제는 녹말을 가수분해하여 Maltose를 생성하므로 소화작용에 있어서 꼭 필요하다. 아밀라아제는 고등동물뿐만 아니라, 고등식물·곰팡이·세균 등 자연계에 널리 분포한다.
실험 기구 및 시약
1. 실험 재료
1) 50㎖ 튜브 5개, 1.5㎖의 microcentrifuge tube 4개, 둥근 바닥을 가진 15㎖ 튜브 6개
2) 마이크로 피펫, 팁, Vortex mixer, 분광광도계, 네임펜, 얼음이 든 아이스박스, 가열기, 증류수
3) Maltose Color Reagent, 녹말, 정제되어 상업용으로 준비된 α-amylase
실험 방법
1. 실험 과정
1) 침 샘플을 희석할 50㎖ 튜브를 4개 준비한다. 각각의 튜브에는 침을 제공할 사람의 이름을 적고, 40㎖의 증류수를 각각의 튜브에 넣고 얼음에 보관한다.
2) 4명의 학생들은 각각 일회용 플라스틱 bulb(끝이 구형으로 불룩한 형태) 형태 피펫에 침을 모은다. 침을 1.5㎖의 microcentrifuge tube로 옮긴다.
3) 마이크로피펫을 이용하여 1.5㎖의 microcentrifuge tube에서 80㎕의 침을 뽑아낸다.
4) 80㎕의 침을 각자의 이름이 적힌 희석 튜브에 넣는다.
5) 각각의 튜브를 닫고 Vortex Mixer를 이용하여 강력하게 섞어준다. 그리고 얼음에 보관한다.
6) 정제된 α-amylase를 희석하기 위한 다른 50㎖ 튜브에 이름을 표시한다. 튜브에 40㎖의 증류수를 넣고 튜브를 얼음에 보관한다.(α-amylase는 Bacillus licheniformis 로부터 정제됨)
7) 농축된 α-amylase 80㎕를 희석 튜브에 넣는다.
8) 둥근 바닥을 가진 15㎖ 튜브 6개 각각에 "blank", “A”, “B”, “C”, “D”, “α-amylase”의 이름을 표시한다.
9) blank 튜브에 1㎖ 증류수를 넣는다.
10) 희석된 침 1㎖와 α-amylase 각각을 맞는 이름이 표시된 튜브에 넣는다.
11) pH7, 1% 녹말 1㎖를 blank 튜브를 포함하여 각각의 튜브에 넣는다. 그리고 튜브를 닫고 섞는다.
12) 각각의 튜브를 정확히 12분 동안 상온에 놔둔다.
13) Maltose Color Reagent 1㎖를 각각의 튜브에 넣는다.
14) 튜브를 닫고 섞어서 100℃ 물중탕에 정확히 15분 동안 놓는다.
15) 튜브를 상온이 될 때까지 얼음에 보관한다. 그리고 각각의 튜브에 9㎖의 증류수를 넣는다.
16) 튜브를 강하게 닫고 상, 하 거꾸로 여러 번 흔들어 준다.
17) blank 튜브를 이용해 분광광도계를 0으로 맞추고, 다른 5개의 샘플의 흡광도를 측정하여 기록한다.
18) Part Ⅰ에서 구한 Maltose 표준 곡선을 이용하여 각 샘플에서 효소 반응 동안 생성된 Maltose의 질량을 계산한다.
19) 효소 배양 단계 동안 각각의 용액 1㎖ 에서 생성된 Maltose의 질량을 계산한다.
20) 각각의 개시 분석 용액의 1㎖에 대한 효소 활성의 유닛을 계산한다. (α-amylase 효소 활성의 유닛은 상온, pH 7에서 1분 동안 녹말을 Maltose 1㎎을 분해하는데 필요한 효소의 양이다.)
실험 결과
1. 결과 분석
기본 실험에서는 40㎕의 침을 넣어 1000배 희석시키라고 나와 있었는데, 그럴 경우 너무 작은 값이 나와 오차가 커질 수 있으므로 그 두 배인 80㎕를 넣어 500배 희석시켰다. 이렇게 침을 희석하고 녹말, Maltose Color Reagent 등을 넣은 후 물중탕을 했을 때 튜브 안의 색이 점점 노란 빛 ～ 붉은 빛을 띠었다. 간혹 어떤 튜브(D 튜브)에서는 붉은 빛을 내는 물질이 아래로 침전되어 뭉쳐있었다. 상온으로 식힌 후 흡광도를 측정했을 때 모두 양의 값이 나왔으나 D의 경우 blank와 동일한 0이 나왔다.
각각의 흡광도는 아래 표에 정리했다.(참고로, α-amylase 튜브가 물중탕을 하는 도중 터져서 다른 조의 α-amylase를 사용했다.)
표준 곡선 식 : y = 0.3072x - 0.0197 (R2 = 0.9951로 상당히 신뢰도가 높음) 이 식에 각각의 흡광도를 y에 넣어 maltose 질량인 x값을 구하였다. 그 결과를 표에 표시하였다.
유닛 공식 : 개시 분석 용액 1㎖에서 생성된 maltose 양 ÷ 12 × z = 1 ⇛ (z = 12 / 개시 분석 용액 1㎖에서 생성된 maltose 양)
즉, 12를 각각의 개시 분석 용액 1㎖에서 생성된 maltose 질량으로 나눠 z(=효소의 양) 값을 구하여 표에 기록하였다.
|
Test Solution |
blank |
A |
B |
C |
D |
α-amylase |
|
흡광도(A540nm) |
0 |
0.016 |
0.002 |
0.013 |
0 |
0.004 |
|
생성된 maltose의 양(㎎) |
0.0641 |
0.1162 |
0.0706 |
0.1064 |
0.0641 |
0.0771 |
|
개시 분석 용액 1㎖에서 생성된 maltose 양(㎎) |
32.02 |
58.1 |
35.3 |
53.2 |
32.02 |
38.55 |
|
개시 분석 용액 1㎖의 효소의 유닛 |
0.3747 |
0.2065 |
0.3399 |
0.2255 |
0.3747 |
0.3112 |
실험 고찰
흡광도의 증가는 녹말의 가수분해로 Maltose양의 증가했기 때문에 생기는 현상이다. 녹말이 분해되면 Maltose와 Glucose 등의 분해산물이 산물로 생기는데, 이때 Maltose는 Maltose Color Reagent와 반응하여 노란 빛 ～ 붉은 빛을 내게 된다. Maltose 양이 적으면 노란 빛을 띠고 중간 정도이면 주황 빛, 많으면 붉은 빛을 띠게 된다. 색이 진할수록 내부 농도가 짙은 것이므로 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하면 그 값 또한 높을 것이다.
효소가 들어있지 않은 blank 튜브에는 녹말이 들어있지 않아 높은 수치가 나오지 않을 것이므로 이를 기준으로 삼아 분광광도계를 0으로 맞추었다. 그리고 각 값을 측정했는데 대체로 정상적인 값이 나왔는데, D 튜브와 α-amylase의 튜브가 정상적인 값을 내지 않았다. D 튜브의 경우 0의 값이 나왔는데 이는 물과 같은 분해력을 가진 것으로, 침에 효소가 존재하지 않은 것을 의미한다.
α-amylase의 경우 -의 수치가 나왔는데, 이는 있던 Maltose 마저 사라진 것을 의미한다. 이에 대해 고찰해 보면 D 튜브의 경우 앞서 얘기했던 것처럼 물중탕을 할 때 붉은 색을 띠는 물질이 밑으로 침전돼서 그런 것으로 추정된다. 붉은 색 침전물은 Maltose Color Reagent와 반응하여 색을 내는 Maltose로 추측된다. 이는, 침을 넣어주었을 때 제대로 혼합해주지 않아 고분자인 효소가 밑으로 가라앉았고, 아래 부분만 효소활성이 왕성하여 그 부분에서만 Maltose가 다량 생성된 것으로 보인다.
따라서 Maltose가 밑에만 생성되었고, 중간과 윗부분은 그만큼 농도가 낮게 된다. 혹시나 몰라 살짝 흔들어 줬지만 너무 흔들면 그것이 다른 요인으로 작용해 변수로 작용할 수 있어 그렇게 하진 못했다. 그런데 이렇게 제대로 혼합시켜 주지 않은 것이 흡광도 수치가 0이 나오게 된 원인이 된 것 같다. α-amylase의 튜브 또한 그런 경우로 보인다. 다른 조의 α-amylase 용액을 썼지만 실험 과정대로 준비를 했을 것이므로 희석 정도는 동일할 것으로 보인다. 하지만 오차가 크게 발생한 것으로 미루어 보아 여러 가지 요인이 작용했다고 추측할 수 있다.
우선, 증류수가 조금 더 첨가되었을 것이다. 증류수를 더 첨가해주면 농도가 낮아질 것이고 색이 옅어질 것이다. 두 번째로 물중탕을 하기 전에 제대로 혼합해주지 못한 경우이다. 물중탕을 하며 침전물이 생긴 경우를 여럿 봤는데 그것의 하나가 이것일거라 추측된다. α-amylase가 고분자이므로 가라앉게 되었고, 바닥에서만 효소 활성이 활발히 일어나 Maltose가 밑 부분에만 생성된 것이다. 따라서 농도가 밑 부분만 짙게 되고 그 위로는 농도가 많이 옅을 것이다.
셀에 시료를 넣을 때 중간 부분(Maltose의 농도가 작은 부분)을 넣어줘서 이런 결과가 생겼을 것이라 추측된다. 세 번째로 아까와 비슷한 경우이지만, α-amylase를 희석하려고 희석 튜브에 넣을 때 α-amylase가 가라앉아서 실질적으로 적은 양이 들어갔을 경우이다. α-amylase는 질량이 크므로 가라앉기 때문에 넣어 주기 바로 전까지 튜브를 흔들어주어야 한다. 그런데 이런 과정을 거치지 않아 α-amylase가 가라앉게 되었고 위 부분을 떠내면서 적은 양이 들어가 오차가 생긴 것이다. 조원 대부분의 경우가 정상적으로 나왔기 때문에 분광광도계가 잘못되었다고 생각되지는 않으며, 오차의 다른 원인도 있을 수 있지만 영향력이 미미할 것이라 생각된다.
흡광도에 따른 Maltose의 양을 구해 Unit 수치(상온, pH 7에서 1분 동안 녹말을 Maltose 1㎎을 분해하는데 필요한 효소의 양)를 구하면, A이 0.2065로, 침에 들어있는 효소 활성이 다른 조원들보다 심지어는 α-amylase(0.3112)보다 좋다고 볼 수 있다. 그런데 이는 잘못된 결과가 아닌가 생각된다. 침 1l 에는 amylase가 약 0.4g 들어있다. 침 전부가 amylase가 아니므로 침과 α-amylase를 동일한 양 넣었을 때 당연히 α-amylase의 활성이 더 좋아야 한다고 생각된다.
효소의 양만을 따지는 것이 아니라면 다른 요인을 따져서 정당화할 수도 있다. 물중탕의 온도는 100℃ 부근으로 실질적으로 튜브에 100℃의 영향을 미치지는 않지만 상당히 높은 열을 가하게 된다. 그렇게 되면 효소가 변성하게 되고 더 이상 효소의 활성은 일어나지 않게 된다. 그런데 침을 넣었을 때 amylase 외의 부분 즉, 그 외 성분이 온도 완충제 역할로 작용해 열로부터 amylase를 보호했을 수도 있다. 그렇게 되면 효소 활성은 꾸준히 일어나게 되고 α-amylase의 반응보다 더 많은 반응을 일으킬 수도 있을 것이다. 이것은 어디까지 가설로써 오차 외의 부분도 고려하기 위해 제시한 것이다. (만약 α-amylase가 애초에 희석된 상태로 존재했다면 위의 결과는 옳다고 볼 수도 있다.)
A 외에 C의 Unit 수치도 그와 비슷했고 따라서 A과 동일하게 음식물을 섭취했을 때 녹말을 잘 분해할 것으로 생각된다. 그 외인 B와 D는 높은 Unit수치를 가지고 있으므로 음식을 섭취했을 때 침에 의한 녹말의 분해는 잘 일어나지 않을 것으로 생각된다. 전체적인 소화를 생각하지 않고 침에 의한 녹말 분해만을 생각하는 것은, 전체적인 소화는 다른 기작도 작용하므로 다른 자료가 주어지지 않고서는 구할 수 없기 때문이다.
그런데 이 값은 사람마다 침에 있는 amylase의 양이 다르기 때문에 생기는 값인지 효소의 활성도 차이인지는 정확히 판단을 하지 못하겠다. 하지만 효소의 활성은 동일한 환경에서 동일할 것이라고 가정한다면 이 차이는 사람마다 침에 있는 amylase의 양에 의해 결정된다. 따라서 각 amylase의 양을 측정해보면 A > C > B > D=증류수 순이다. 오차를 무시하고 실험 결과가 적절하게 도출되었다고 가정한다면 사람마다 침에 들어있는 효소의 양이 다르다고 할 수 있으며, 침에는 α-amylase가 들어있어 음식물의 녹말을 Maltose와 그 외 생성물로 분해한다는 결론을 내릴 수 있다. (다른 효소일 가능성도 있지만 기초적 지식이 있으므로)
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