동결건조법
조작이 저온에서 이루어지므로 열에 약한 물질의 건조법으로 유용하다. 이 방법은 미생물, 의학, 약학방면에서 수분이 많을 때는 불안정하고 또한 열에 극히 민감한 재료(세균, 바이러스, 혈장, 혈청)등을 이 방법에 의해 –10 ～ -30℃의 저온에서 건조시켜 보관하면 상온에서 장기간 보존할 수 있고 물에 대한 용해성이 뛰어난 제품을 얻을 수 있다. 또 식품공업에서 육류, 어류, 야채, 과즙 등을 건조시킬 때 이 방법으로 건조시키면 향, 맛이 남고 천연품에 가까운 인스턴트 음식을 얻을 수 있다.
동결보존시 이용하는 동결보존제는 세포 동결시 세포손상을 막아주는 역할을 하며 이 보존제를 동결배지에 넣어준다. 동결보호제는 세포외액에 얼음결정이 생성될 때 발생하는 삼투압 스트레스로 인한 세포손상을 막아주고 세포에 치명적인 세포내 얼음결정 형성을 막아준다. 동결보호제는 세포막투과성이 좋아서 세포내로 들어가 지나친 동결건조를 예방하고 중요한 분자를 보호하며, 세포에 독성이 적어야하고, 용해도가 좋아야 한다. 동결보호제의 종류는 DMSO, glycerol, 1,2-propane-dioll, sufrose, methanol, glycose, lactose, glycine 등이 있는데 DMSO나 glycerol을 가장 흔하게 사용한다.
DMSO는 냉동과정에서 세포의 죽음을 방지하기 위해 사용할 수 있다. 약 10%정도 느린 속도로 동결되며 -80℃로 냉동할 수 있다. 그리고 액체질소에도 안전하게 저장된다. DMSO로 작업할 때에는 장갑을 꼭 끼고 작업해야한다. DMSO에 녹아있는 물질이 침투외어 쉽고 빠르게 인체로 흡수될 수 있다. 예를 들어 시안화나트륨에 의한 청산가리중독이 있다. DMSO는 진통, 국소방지, 염증을 빠르게 낫게하기 위한 약물전달시스템으로 사용 되고 있다. 그리고, 동결과정이 이루어진 후 -196℃의 액체질소 용기에 보관해야하며 동결세포가 장시간 가장 안전하게 보관될수 있는 온도는 -130℃ 이하로서 일반적으로 초저온 냉동고를 사용하여 보관할 경우 -70℃를 유지하게 되는데 이 온도에서는 세포내 물질대사가 완전히 멈춘 상태가 아니므로 1개월 이상의 장기보관은 불가능하다.
계대배양
세포증식을 위해 새로운 배양접시에 옮겨 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법으로, 이것은 제한된 배양접시 내에서 세포가 증식을 멈추게 되므로 이것을 막고 세포가 증식할 수 있도록 새로운 공간을 제공하는 것이다. 세포를 떼어내게 되면 배양접시나 시험관에서 배양하게 된다. 배양접시에서 세포를 배양하면 세포는 배양접시의 바닥에 한 층으로 붙어서 자라게 된다. 이 상태로 세포들이 계속 배양하게 되면 더 이상 증식할 수 있는 공간이 없어서 증식을 멈추게 된다. 이러한 세포들을 계속 증식하게 하려면 세포의 일부를 배양접시에서 떼어서 새로운 배양접시에 옮겨 주어야 하는데 이를 계대배양이라고 한다.
초저온 동결
액체질소 동결이라고도 한다. 초저온동결법은 액체질소를 사용한 동결저장법이다. 액체질소는 무미, 무취, 무독하며 화학적으로 비활성이므로 취급하기 쉽기 때문에 초저온 동결매체로서 뛰어난 재료이다. 증발할 때 높은 숨은 열을 필요로 하는데 이것을 이용하면 처리재로 속의 수분이 급속하게 미세한 얼음으로 변한다. 이 현상은 생세포 에서는 세포질에 해를 입히지 않고도 산소 활성을 억제하고 세포가 가지는 유전적 특성을 유지하여 장기간동안 저장할 수 있으며 급속한 해동으로 복원이 가능하다.
실험 기구 및 시약
1. 실험 재료
1) TSB배지, 알코올램프, 백금이, E.coli배지, shaking incubator, glycerol 40%, 1.5㎖ tube
2) yellow tip, 파이펫, Defreezer, 70%알코올, clean bench
실험 방법
1. 실험 과정
1) TSB배지가 들어 있는 시험관 입구를 멸균한다.
2) 백금이를 멸균한 후 E.coli가 들어있는 시험관에 넣었다.
3) 모든 균이 백금이에 잘 묻게 해주었다.(백금이에 잠기는 백금이 부분까지 꼼꼼하게 멸균하기)
4) 백금이를 꺼내 TSB배지에 잘 섞이도록 저어주었다.
5) 배지가 든 시험관을 멸균한 후 뚜껑을 닫아주었다.
6) shaking incubator에서 37℃로 하루 동안 배양했다.
7) 배양한 E.coli를 열어 파이펫에 팁을 꽂은 후 100㎕를 땄다.
8) 1.5㎖ tube에 100㎕를 넣어주었다.
9) 팁을 바꾼 후 40% glycerol 100㎕를 땄다.(glycerol 40㎕+D.W 60㎕ → 총 100㎕중 glycero이 40㎕이므로 40% glycerol)
10) 40% glycerol을 1.5㎖ tube에 넣은 후 5번 정도 펌핑 해 내용물을 섞어줬다.
11) 1.5㎖ tube를 Defreezer에 보관했다(-60℃)
실험 고찰
본 실험에서는 세포를 배양하고 보존하는 법에 대해 실험을 했다. 세포배양이란 다세포 생물에서 세포를 분리하여 증식시키고 유지하는 일이다. 세포의 증식이나 기능 실험에서는 다른요소를 배제하기 위하여 무균조작을 한다. 우리가 실험한 것은 세균의 증식으로 다세포 생물에서 세포를 분리한 것과 달리 한 개의 세균에서 분열을 하는 원리를 사용하여 분열된 세포를 다른 곳으로 옮겨서 키우는 것을 말한다.
대장균의 세대시간이 20분 정도이며 포도상구균, 연쇄구균은 25～35분, 결핵균은 20시간정도로 대장균의 세대시간은 비교적 짧다. 따라서 대장균 한 개는 10시간이 지나면 (약 )개가 된다. 계대배양을 했는데 계대배양을 하는 이유는 고체배지에서 증식을 시키면 배지가 굳기 때문에 한계가 있기 때문이었다. 그렇기 때문에 비교적 오래 보관 할 수 있는 방법으로 사용하는 것이다. 계대배양이 습도가 높으면 입구에 곰팡이가 생길 수 있기 때문에 건조상태를 유지하는 것도 중요하다. 그러나 마게를 솜이 아닌 실리콘이나 고무로 하면 곰팡이를 막을 수 있다.
세포를 보존하는 방법에는 광유에 보조시키는 방법도 있는데, 이 방법은 시험관에 paraffin을 넣어 균에 산소공급을 차단하고 균의 대사를 억제시켜 보존하는 것 인데, 세균, 방선균, 사상균의 보존에 이용되고 있다. 이때 유동 paraffin은 질이 좋은 것을 택하고 120℃에서 1～2시간 고압살균 후 건조시켜 사용한다. 실험에서는 40% glycerol을 사용했는데 이 물질도 동결보호제로서 온도가 급격하게 낮아지는 현상을 방지해준다. Defreezer에 이소프로판올을 사용하는 경우도 있는데 온도가 갑자기 차가워지면 동결튜브가 깨지므로 이를 방지하기 위해 사용하는데 보통 이 물질은 미생물 중에서도 잘 자라지 않는 것들을 키울 때 사용한다.
glycerol을 40%를 사용하는 이유는 다른 어떤 농도보다 40%일때 세포의 복구가 빠르고 안전하게 일어나기 때문이다. 본 실험에서는 백금이를 잘 멸균하고 액체배지에 잘 녹아나게 해야 되는 실험이었는데, 모든조가 비슷하게 잘 자랐다. 그러나 아직 하루정도의 시간밖에 지나지 않아 많이 뿌옇거나 pallet가 많이 형성되어 있지 않았다.
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