생화학실험 | Plasmid DNA Purification

 

 

 

Plasmid는 bacteria 세포의 염색체와는 별도로 존재하면서 self-replication을 할 수 있는 원형 DNA 분자로 적은 수의 gene을 가지고 있다. 이 plasmid는 유전자 재조합 시 재조합 DNA 조작을 위한 vector DNA(숙주에 이종의 DNA를 운반하는 DNA)로 사용되며 원하는 DNA 단편을 넣어 gene cloning 등에 널리 이용된다. Plasmid는 주로 대장균 세포에서 증식되며 vector DNA로 사용되기 위하여 대량 증식된 대장균 세포로부터 분리하여 사용하게 되는데 대장균 세포내에서 염색체와는 별도로 존재하기 때문에, plasmid DNA 분리는 염색체 DNA가 포함되지 않게 분리하는 방법이 사용되게 된다.

 

이러한 분리 방법 중 널리 사용되는 방법 중 하나가 Alkaline Lysis법이다. Alkaline Lysis법이란 높은 pH의 알카리성 anionic detergent용액을 이용하여 대장균 세포를 lysis 시키고 plasmid를 염색체 DNA와 구분하여 분리하는 실험법으로 그 원리는 다음과 같다. Alkaline Lysis법에서는 높은 pH의 alkaline 용액 상태에서 염색체와 plasmid의 크기 및 topology에 의하여 염색체와 혼합된 상태로부터 plasmid만 분리하게 된다. Alkaline 상태의 anionic detergent 용액에서 detergent에 의해 세포가 lysis 되어 염색체와 plasmid 모두 alkaline 용액에 노출되면 두 형태의 DNA 모두 변성되게 되어 이후 산성 용액을 혼합하여 중성 상태가 되면, 염색체는 크기가 너무 커서 변성 전의 정상적인 topology로 복원되지 못하고 더욱 엉기는 반면에, plasmid는 크기가 작기 때문에 정상적으로 복원된다.

 

이때, 원심분리를 거쳐 엉긴 염색체는 세포 찌꺼기 및 변성된 단백질과 함께 detergent와 엉긴 채 흰색의 침전물로 가라앉고, plasmid는 용액에 녹아 염색체와 구분되어 분리된다. 용액에 녹아있는 plasmid는 ‘에탄올 침전법’이나 ‘Silica 막을 통한 흡착 후 용출법’에 의해 purification한다. Purification의 여부는 agarose gel electrophoresis을 통해 확인해 볼 수 있다.

 

DNA electrophoresis의 원리는 다음과 같다. DNA의 골격은 인산기에 의해 음전하를 띄고 있기 때문에 전압을 걸어주었을 때 양전하의 방향으로 이동하게 된다. 이 때, DNA는 젤을 통과하며 분자량이 큰 것일수록, 또 구조에 따라서 속도가 느려지게 된다. 따라서 영동을 마친 후 DNA ladder를 통해 DNA의 분자량을 알아볼 수 있다.3) 이번 실험에서는 직접 plasmid DNA purification을 해보고 agarose gel electrophoresis를 통해 DNA purification 여부를 확인하며 DNA의 구조에 의한 추출 원리를 이해한다.

 

 

실험 방법

[실험 1] Plasmid Preparation

① 배양액이 든 튜브에 250㎕ resuspension buffer를 넣고 vortex시킨 후 250㎕ lysis buffer를 넣고 조심스럽게 6-8회 inverting한다.

 

② 또 350㎕ neutralization buffer를 넣고 마찬가지로 조심스럽게 6-8회 inverting한 후 원심분리(13000rpm, 10분)시킨다.

 

③ 맑은 solution만 spin column (w/collection tube)에 옮기고 원심분리(13000rpm, 1분)시켜 여과액은 버리고 500㎕ wash buffer A를 넣고 다시 원심분리(13000rpm, 1분)시킨 후 여과액을 버리고 700㎕ wash buffer B를 넣어 원심분리(13000rpm, 1분)시킨 후 여과액을 버린 다음 원심분리(13000rpm, 1분)시킨다.

 

④ Spin column을 새 microcentrifuge tube에 놓고 50㎕ elution buffer를 넣어 1분 기다린 다음 원심분리(13000rpm, 1분)하여 eluate를 얻는다.

 

[실험 2] Agarose Gel Electrophoresis

① DNA sample을 spin down 시켜준 후 sample 20㎕와 loading buffer 5㎕를 섞어준다.

 

② Loading buffer와 섞어준 sample 20㎕를 젤에 loading 시켜 100V에서 25분간 전기영동 시킨 후 ③ UV transilluminator를 이용하여 관찰해본다.

 

 

 

[생화학실험]Plasmid DNA Purification 레포트