1. Hydrazine 비색법의 원리를 이해하여 본다.
2. 시료(레몬)의 총 비타민C 함량을 구할 수 있다.
Hydrazine 비색법
이 방법은 매우 미량의 vitamin C도 정확하게 정량할 수 있다는 것이 장점이다. 산화형 비타민 C (Dehydroascorbic acid)는 2,4-dinitrophenyl hydrazine(이하 DNP)과 작용하여 정량적으로 적색의 osazone을 생성하므로 이의 85% H2SO4 용액의 정색을 비색 측정하여 산화형 비타민 C를 정량할 수 있다.
즉, 시료 중의 ascorbic acid를 산화하여 dehydroascorbic acid로 만들고, 시료 중에 처음부터 함유되어 있는 산화형 비타민 C와 함께 정량하여 총 비타민 C의 양으로 한다. 처음부터 함유되어있는 산화형 비타민 C 만을 별도로 정량하면 양자의 차로부터 ascorbic acid의 산화에는 앞서 기술한 indophenol이 흔히 사용되며, 반대로 ascorbic acid의 산화방지에는 thiourea 또는 염화 제 1주석(SnCl2)이 사용된다. Hydrazine법은 indophenol법보다 정밀도가 높고 비타민 C함량이 낮을 경우에도 정확히 측정된다.
실험 방법
1. 실험 과정
1) 시험관 14개를 준비한 다음 label을 달아 구분한다. 비타민C, 1,2,3,4,5㎎%, blank를 각각 2개씩(공시험용, 측정용) 14개에 label을 달아준다.
2) Hydrazine 비색법의 측정 조사순서 일람표를 보고 실험을 해나간다.
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총 비타민 C 공 시험용 |
총 비타민 C 측정용 |
측정용 AA표준용액 공 시험용 |
측정용 AA표준용액용 |
시료용액(㎖) 측정용 AA표준용액(㎖) |
2 - |
2 - |
- 2 |
- 2 |
DCP 용액(㎖) thiourea-HPO3 용액(㎖) DNP 용액(㎖) |
1 2 - |
1 2 1 |
1 2 - |
1 2 1 |
항온수조(50℃)중에서 70분간 방치 |
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85% H2SO4(㎖) DNP 용액(㎖) 흡광도 측정 |
5 1 |
5 - |
5 1 |
5 - |
실온(빙수 중)에서 30분간 방치 후 파장 520㎚에서 흡광도를 측정 |
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측 정 값 |
E0 |
E |
Eo' |
E’ |
모든 시약을 가하고 난 뒤에는 vortex mixer로 섞어 준다.
3) 공 시험용과 측정용의 차이는 DNP용액을 넣는 순서의 차이다. 그러므로 두 방법이 섞이지 않도록 구별을 잘하고 공 시험용은 항온수조에 넣을 때 측정용보다 양이 작아야한다. (DNP 용액을 아직 넣지 않았기 때문에 1㎖ 차이가 나야한다.)
4) 항온수조에 넣는 시간은 수조의 온도에 따라 조절될 수 있다. 37℃에서는 3시간 방치, 50℃에서는 70분은 방치하게 된다.
5) 85% H2SO4을 가할 때는 위험하므로 주의해야한다. 공 시험용에만 DNP 용액을 넣은 뒤 모든 시험관의 수위가 같은지 본다. 만약 시험관에 들은 용액의 양에 차이가 생긴 다면 그것은 중간에 실험을 빼먹었다는 뜻이다. 확인이 끝났으면 찬물이 담긴 수조에 시험관을 넣어 식히도록 한다.
6) 손 보호를 위해 수술용 장갑을 끼고 셀에 흡광도를 측정할 용액을 약 3/2정도 담아 차례로 상자에 넣는다. 이렇게 하면 흡광도 측정을 보다 쉽고 빠르게 진행할 수 있게 된다.
7) spectrophotometer에 용액이 담긴 셀을 넣고 흡광도를 측정한다.
8) 총 비타민 C의 함량을 구해본다.
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