생화학실험 | His–Tag 단백질의 정제 - Purification of His-tagged proteins

 

 

 

TIP

 

 

1. 단백질을 정제하는 목적
1) 가능한 최고의 회수율
2) 최고의 생물학적 활성 유지
3) 최고의 순도

 

 

 

His-tag 단백질 / Ni-NTA

현재 재조합 단백질을 정제하는데 가장 많이 사용되는 방법이다. 다시말하면, 단백질을 구성하는 아미노산 중 히스티딘이 금속 이온과의 배위 결합에 강하게 관여한다는 연구 결과가 있다. 6개(혹은8개)의 His을 연속으로 달아놓으면 Ni등의 금속이온과 배위결합을 생성한다.

 

Ni이 레진에 결합되어 있으면 His을 달아 Ni결합 레진에 단백질이 달라붙는데(Ni고정-NTA사용)이런 성질을 이용해 단백질을 정제한다. 따라서 유전자 공학적으로 단백질의 말단에 다수의 히스티딘을 첨가하면 단백질의 금속 이온 친 화성이 현저히 증가하여 쉽게 정제가 가능하다.

 

His-tag protein

 

히스태그를 갖는 단백질을 pH 8 이상의 조건 ​​하에서 니켈 등의 금속 이온이 고정화 된 운반체에 접촉 시키면, 히스티딘 잔기가 금속 이온을 킬레이트 화하여 운반체에 결합한다. 다른 단백질은 운반체에 결합하지 않거나 아주 약하게 결합하기 때문에 운반체를 적절한 완충액으로 세척하여 제거 할 수 있다. 그 후, 운반체로부터 이미다졸 등을 제거함으로써, 히스태그를 갖는 단백질을 고순도로 회수 할 수 있다. 히스티딘은 태그가 매우 작으므로 다른 단백질에 결합되어도 단백질의 기능에 큰 영향을 미치지 않을 가능성이 높다.

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실험 방법

1. His-tag 단백질의 발현

1) 밤새 키워둔 발현용 대장균 배약액 1.5㎖를 100㎖의 LB 액체 배지 + kanamycin (20μg/㎖) 배지에 넣고 A₆₀₀=0.5 까지 키운다.

 

2) IPTG(1M)을 넣고 전과 똑같은 조건으로 3시간 더 배양한다.

 

3) 50㎖ 코니칼 튜브에 배양액을 담고, 원심분리하여 세포침전을 만들고, 상층액의 배지는 버린다.

 

4) 이 과정을 두 번 반복하고, 차가운 물로 세포침전을 용해시킨 후 다시 차가운 물을 첨가하여 섞고, 원심분리하여 상층의 물을 버린다음 초저온 냉동고에 얼려둔다.

 

2. His-tag 단백질의 용출

1) 얼려둔 세포침전을 완전히 녹인 후, 15㎖의 Binding버퍼를 넣어 섞는다.

 

2) 초음파분쇄기를 사용하여 단백질을 파쇄시키고(모든 과정에서 튜브를 얼음물에 담군 채 진행한다.) 원심분리를 하여 15㎖ 튜브에 옮겨 담는다.

 

3. 니켈-컬럼 친화 크로마토그래피

1) 미니 컬럼(니켈)을 지면이 수직이 되도록 세워놓은 스탠드에 고정시켜 최대한 수평을 맞춘다. 미니 컬럼의 아래부분을 3-way cock로 막고, 1㎖의 물을 주입한다. Ni-NTA 레진 병에서 2㎖를 조심스럽게 넣은 후 1～2분을 기다렸다가 중력에 의해 액체가 모두 빠져 나갈 때 까지 기다린다.

 

2) 10㎖의 바인딩버퍼를 미니컬럼에 통과시켜준다. 이 때 처음 넣는 경우 천천히 넣어주고, 레진 표면이 편평하게 유지되도록 한다.

 

3) 버퍼가 레진 위로 조금 남았을 때, 아래 마개를 막아 레진이 마르지 않게 한다. 앞서 얻어진 LO 단백질 용액을 미니 컬럼에 조심스럽게 넣고 흐르게 한다.

 

4) 아래쪽에서 흐르는 액을 15㎖ 튜브에 모으고, F₁이라고 레이블을 해서 보관한다.(이 때 보관은 –20℃의 냉동고) 15㎖의 바인딩버퍼를 두 번에 나누어 컬럼에 주입하고, 흐르게 한다.

 

5) 이를 W₁이라고 레이블을 해서 보관한다.

 

6) 10㎖의 Wash버퍼를 두 번에 나누어 컬럼에 넣고 흐르게 한다. 전과 똑같은 방법으로 15㎖의 튜브에 넣어 보관한다.(W₂)

7) 10㎖의 Elute버퍼를 컬럼에 넣고 흐르게 한 후 아래쪽으로 통과되는 액을 1.0㎖씩 epp튜브에 따로 모으로 E₁～E₁₀순서대로 레이블을 하여 보관해준다.

 

 

 

[생화학실험] His–Tag 단백질의 정제 - Purification of His-tagged proteins 레포트