일반생물학실험 | PCR(Polymerase Chain Reaction)

 

 

 

TIP

 

 

PCR과 전기영동법을 이해하고 증폭된 DNA를 관찰하기 위해 실험을 시행한다.

 

 

 

PCR(Polymerase Chain Reaction)

중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 1983년 Kary Mullis에 의해 고안 되었는데 이는 80년대 제한효소의 발견에 의한 Gene Cloning법에 이어 90년대를 화려 하게 장식한 생명공학 연구의 혁명적인 사건이다. PCR은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하므로 분자 생물학적으로 제한효소의 발견만큼 획기적인 것이라고 할 수 있다.

 

중합효소 연쇄반응을 통하여 in vitro상에서 특정 부위의 DNA를 105~108 배까지 수시간내에 증폭시킬 수 있으며, 이렇게 증폭된 DNA를 여러가지 실험에 이용할 수 있고, 실험 결과를 토대로 여러 의학적인 연구에 응용할 수가 있다. PCR은 이제 분자생물학 전반에 널리 관여하고 있어서 PCR이 적용되지 않는 실험은 생각하기 어려울 정도가 되었다. 이제는 매일 같이 PCR 관련 기법이 쏟아져 나오고 있어 PCR 응용분야가 더욱 더 확대되리라 생각된다.

 

 

PCR의 소개

유전자를 분석하고 연구하는데 있어서 가장 큰 문제점은 복잡한 전체 genome중에 연구 하고자 하는 유전자가 희귀하다는 것인데, PCR은 특정 DNA Sequence의 copy수를 기하 급수적으로 증폭시킬 수 있다는 점이다. 먼저 DNA의 구성을 살펴보면 DNA는 다음과 같이 phosphate group(인산기) - sugar(당) - base(염기)의 세 가지 요소로 구성되는 nucleotide라는 모듈이 쌍으로 연결된 것으로 이것이 이중나선 모양으로 위아래로 연결된 모양을 하고 있다.

 

염기의 종류는 A (adenine), G (guanine)으로 구성된 purine group과 T(thymine), C(cytosine), U(uracil)로 구성된 pyrimidine group으로 나뉜다. DNA에서는 T로, RNA에서는 U로 존재한다. 또한 당의 2번위치에 있는 OH group을 갖고있진 않은 것이 DNA이며, 갖고 있으면 RNA가 되는데 이 것으로 인하여 DNA와 RNA사이에는 많은 성질의 차이가 발생한다. phosphate group이 있는 쪽이 5`(prime) 방향, sugar가 있는 쪽이 3` 방향인데, 쌍으로 연결되는 염기는 그림과 같이 서로 반대방향(anti-parallel)으로 위치하는 것 이 특징이다. 즉, DNA 사슬은 서로 5` 과 3` 방향이 반대이다. 이때 3` 방향에 노출되어 있는 3` OH기를 연결 고리로 하여 DNA polymerase가 다음 nucleotide를 붙여주기 때문에 DNA 의 합성은 반드시 5` 에서 3` 방향으로만 진행된다. 또한 DNA polymerase는 3` OH를 제공할수 있는 primer가 반드시 존재해야 한다.

 

PCR은 이러한 DNA polymerase의 성질을 이용한다. DNA polymerase가 단일가닥 DNA를 주형으로 해서 상보적인 DNA를 합성한다. 이러한 단일가닥 DNA는 두가닥 DNA를 끓임(denature)으로써 간단하게 얻을 수 있다. 여기에 primer를 넣어주면 특정 DNA sequence의 양끝에 결합(anneal)하여 DNA polymerase가 DNA 합성을 시작할 수 있도록 해준다. 일단 primer가 결합한후에는 DNA polymerase의 작용으로 DNA 합성이 반대편 끝까지 진행(extend)된다.

 

이렇게 ①denaturation ②annealing ③extension이 한 cycle이 된다. 다음 cycle에서 original DNA와 새로 합성된 DNA가 분리되어 단일가닥 DNA 주형이 된다. 따라서 n cycles후에는 이론적으로 2n의 두가닥 DNA가 존재하게 된다. DNA를 변성 시키면 DNA polymerase도 같이 변성되므로 매 cycle마다 DNA polymerase를 넣어주어야 한다. 그러나, Thermus aquaticus라는 온천에 사는 세균이 발견되면서 이 문제는 해결되었다. 이 세균의 DNA polymerase(Taq polymerase)는 72℃가 최적온도이며, 94℃에서도 안정하다. 따라서, Taq polymerase를 사용하면 매 cycle마다 DNA polymerase를 다시 넣지 않아도 된다.

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실험 방법

1. 실험 과정

denaturation	2/min	95℃
denaturation	10/sec	94℃	40 cycles
annealing	1/min	55℃
extension	2/min	68℃
extension	20/min	72℃

 

1) denaturation 변성 : 고온에서 DNA 염기사이에 수소결합을 끊어 이중가닥으로 된 DNA를 한가닥으로 분리

 

2) Anneling 결합 : 분리된 DNA 가닥에 primer 결합

 

3) Extension 중합 : primer로부터 DNA가 뻗어나가면서 polymerase에 의한 DNA 합성

 

 

 

 

PCR(Polymerase Chain Reaction) 레포트