일반생물학실험 | 단백질과 DNA의 정량

 

 

 

TIP

 

 

1. 단백질을 구성하는 아미노산의 구조와 특성을 이해하고 아미노산의 특성을 이용한 몇 가지 단백질 정량 방법을 이해한다
2. 대표적인 단백질 정량방법인 Bradford assay와 Lowry method를 이용하여 단백질을 정량 한다
3. DNA의 구조 및 DNA를 구성하는 네 가지 염기의 구조와 특성을 이해하고 DNA의 정량 방법과 순도결정 방법을 실험한다.

 

 

 

Bradford Assay

1. 원 리

① Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBBG) 가 arg, trp, tyr, his, phe에 결합시 흡광도의 변화를 측정한다

 

② dye는 6개의 phenyl groups 과 2개의 sulfonic acid groups을 통해서 단백질과 결합한다. hydrophobic (Tryptophan, Tyrosine, Histidine and phenylalanine) 과 electrostatic (arginine, Lysine) residues를 통해 주로 약하고, noncovalent한 결합을 한다.

 

③ Coomassie Brilliant Blue G-250 dye 는 세가지 형태로 있다. red (λ max = 470 ㎚), blue (λ max = 590 ㎚) and green (λ max = 650 ㎚).

 

④ CBBG 은amino acid와 결합하여 anionic form을 가지고, 595 ㎚ 최대흡광을 (blue)을 가진다. free dye의 경우 cationic form 으로 최대 흡광은 465 ㎚ (red)이다.

 

⑤ 강한 산성 상태에서는 dye는 doubly-protonated red form으로 가장 안정한 형이고, 단백질에 결합시에 dye는 unprotonated, blue form이 가장 안정한 형이다.

측정범위 : 1-20㎍(microassay), 20-200㎍(macroassay)

 

2. 장점

① 빠르고(10분) 저렴하다.

 

② 단백질에 매우 특이적이다(Highly specific )

 

③ 높은 감도를 가진다( sensitive )

 

④ 다양한 단백질에 이용가능하다.

 

⑤ dye-complex는 약 1시간동안 안정하다.

 

3. 단점

① 넓은 범위에 걸친 standard curve의 경우 non-linear하다

 

② 각각의 단백질의 대한 반응이 다양할수 있으므로 standard의 선택이 중요하다.

 

③ 사용되는 단백질은 비가역적으로 변성된다

 

④ 2개의 Coomassie Brilliant Blue G-250 species 의 흡광도가 부분적으로 겹치므로 standard curve를 만드는 것이 매우 중요하다.(non-linear curve 형성)

 

4. 주의 사항

① dye는 tyr, trp, his, phe보다 arg에 약 8배는 많이 반응한다

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실험 방법

1. Bradford Assay

1) 표와 같이 적당한 농도의 BSA 용액 시료를 만들어 595㎚에서 흡광도를 측정한다.

 

2) 표준시료를 이용해 595㎚에서 얻은 흡광도를 1㎖에 들어있는 BSA의 농도에 따라 표준 시료 그래프를 작성한다

 

3) 측정하고자 하는 단백질 시료의 적당량을 이용해 표준 시료와 같은 조건으로 용액을 만들어 595㎚에서 흡광도를 측정한다

 

4) Standard curve를 이용해 얻어진 방정식에 단백질 시료를 통해 얻어진 흡광도 값을 대입하여 1㎖ 용액에 용해되어 있는 단백질 시료의 농도를 구한다.

 

5) 20㎕의 단백질 시료를 사용하였따면 전체 1㎖ 의 용액을 단백질 시료가 50배 희석 된 상태에서의 농도이므로 위의 Standard curve를 이용해 구한 단백질 농도에 희석 배수 (D) 50을 곱하면 측정하고자 하는 단백질의 최종 농도를 구할 수 있다.

 

2. Lowry method

1) BSA를 이용해 standard curve 작성을 위한 시료를 아래 표와 같이 준비한다

 

2) 주어진 단백질 시료의 몇 가지 농도를 전체 부피가 200㎕가 되게 준비한다

 

3) 200㎕ 2M NaOH, 4㎖ alkaline reagent를 가한 후 상온에서 10 분 동안 방치한다

 

4) 2배 희석된 Folin reagent를 400㎕ 씩 가한 후 상온에서 30분 동안 방치한다.

 

5) 750㎚ 에서 BSA 표준 시료와 측정하고자 하는 단백질 시료의 흡광도를 측정한다

 

6) Standard curve를 작성하고, 단백질 시료의 단백질 양을 구한다

 

3. DNA의 정량과 순도 측정

1) DNA 시료를 10mM Tris-HCL pH7.5 용액으로 정확하게 희석(60배 희석)하여 0.6 ㎖을 준비한다. (10㎕ DNA + 590㎕ 10mM Tris 용액)

 

2) 10mM Tris 용액으로 reference를 설정해 준다

 

3) DNA 시료를 quartz cuvette에 옮기고 260㎚ 와 280㎚에서 흡광도를 측정한다

 

4) DNA 농도를 구하는 식에 대입하여 농도를 구하고 A260/A280 비를 계산하여 DNA 시료의 순도를 측정한다

 

 

 

 

 

[일반생물학실험]단백질과 DNA의 정량 레포트