분자생물학실험 | E-coli Plasmid DNA 정제

 

 

 

플라스미드(plasmid)

플라스미드는 외부염색체 DNA분자를 작은 염색체로 전이 이동시키는 것이다. 정의에 따라 플라스미드는 복제단위(replicon)로써 외부염색체 상태에서 안정적으로 유전되는(특별한 분리 없이 유지되는)물질 이다. 전부는 아니지만 대개의 플라스미드는 세포의 생존에 꼭 필수적인 것은 아니다. 그러나 항생제가 존재하는 여러 경우에서는 생존에 필수적인 존재가 되기도 한다. 플라스미드의 기본적 특징은 다음과 같다.

 

1) 세포내에서 염색체와는 독립적으로 존재하는 환상의 DNA이다.

 

2) 세균의 항생제에 대한 저항성은 세균이 갖고 있는 플라스미드에 기인된다. (선발표지로 이용된다.)

 

3) 모든 플라스미드는 복제 개시점(origin of replication)이 될 수있는 적어도 한 개의 DNA 염기서열을 갖고 있어 세포내에서 세균의 염색체와 독립적으로 존재한다.

 

4) 작은 플라스미드는 복제시 염색체의 효소를 이용하지만 큰 플라스미드는 자체에 복제효 소를 가지고 있다.

 

5) 어떤 플라스미드는 세균의 염색체 속으로 플라스미드를 삽입시켜 복제 될 수 있다. → 통합적 플라스미드 또는 episome이라고 한다. (세포가 분열해도 안정적으로 다음으로 유 전된다) → 박테리오파지 염색체의 중요한 특성.

 

플라스미드의 크기와 복제 개수(copy number)는 플라스미드 1kb - 250kb이상 까지 다양하며, 이때의 복제개수로서의 의미는 하나의 세균세포내에 존재하는 각각의 플라스미드 분자수를 말하는 것이다. (적게는 한 개에서부터 50개) 플라스미드는 또한, 접합적인것과 비접합적인 것으로 구분되는데, tra유전자, transfer 유전자가 있는 플라스미드를 접합 성플라스미드라하며, 어떤 경우는 즉, 특수한 어떤 경우에는 비접합성과 접합성이 공존 할 수가 있다. 플라스미드는 양립성을 (compatibility) 가지고 있어 한 세포안에 서로 다른 종류의 플라스미드가 대장균 안에 7종까지 존재할 수 있다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 15,000rpm for 1min or 13,000rpm for 5min 조건하에 원심분리하여 세포액을 얻는다.

 

2) Solution I 200μl를 넣고 10분간 상온에 반응시킨다.

 

3) Solution Ⅱ 200μl를 넣고 10회정도 gently하게 섞어주고 10분간 상온에 반응시킨다.

 

4) 얼음속에 보관해둔 Solution III 200μl를 넣고 강하게 섞어준뒤 10분간 상온에 반응시킨다.

 

5) 15,000rpm for 1min 동안 원심분리한다.

 

6) 600μl의 상등액을 미리 만들어둔 컬럼에 넣는다.

 

7) vacuumn을 이용하여 여과시킨다.

 

8) 1.5㎖ DNA wash buffer를 이용하여 washing해준다.

 

9) jacket form으로 분리시키고 15,000rpm 15sec간 원심분리 시킨다.

 

10) 50μl의 증류수를 이용하여 15,000rpm 15sec간 원심분리 시켜 DNA시료를 용출시킨다.

 

11) 얻은 DNA시료를 전기영동시켜 결과를 확인한다.

 

 

 

E-coli Plasmid DNA 정제 레포트