촉매 작용
촉매는 화학 반응을 촉진시킨다. 촉매는 한 반응에 개입하고 그 반응 과정 중 물리적인 변화를 받지만 반응이 완료되면 원상태로 돌아간다. 효소는 생물계에서의 화학 반응에 대한 단백질 촉매이다. 생세포에서 대부분의 화학 반응은 효소에 의한 촉매에 의하지 않으면 매우 늦게 일어날 것이다.
비단백성 촉매(H+, OH-, 또는 금속 ion)와는 대조적으로 각 효소는 소수의 반응, 흔히 단 하나의 반응만을 촉매할 뿐이다. 그러므로 효소는 반응에 특이적인 촉매이다. 모든 생화학적 반응이 효소에 의하여 촉매되므로 많은 여러 가지 효소가 존재해야 한다.
조효소
많은 효소들은 조효소라고 불리는 내열성 특정 비단백태 유기 분자의 존재 하에서만 그 기질의 반응을 촉매 한다. 효소와 조효소가 존재할 때에만 촉매 작용이 일어난다. 조효소가 요구되는 경우에는 그 완전한 계 또는 holoenzyme은 단백질 부분 또는 apoenzyme과 apoenayme단백질에 결합되어 있는 내열성이며 투식성인 비단백테 조효소(coenzyme, apoenzyme에 공유결합으로 결부된 조효소를 지칭하는데 “보결 분자족”이라는 낱말이 앞에서 사용된 바 있다. )로 구성된다. 흔히 조효소의 개입을 요구하는 반응의 형태는 산화 환원, 기전이 및 이상화 반응 그리고 공유 결합의 형성을 결과하는 반응이다. 대조적으로 소화관의 효소에 의하여 촉매 되는 가수분해 반응을 포함하여 분해 반응이 조효소를 요구한다고는 알려지지 않았다.
① 제 2의 기질
조효소를 제 2의 기질, 즉 조기질(cosubstrate)로 간주하는 것이 자주 도움이 된다. 이에는 적어도 두 가지 이유가 있다. 첫째의 경우 조효소에서의 화학 변화는 기질에서 일어나는 것과 정확하게 일치한 가령 산화 환원(탈수소 효소)반응에서 한 분자의 기질이 산화되고(탈수소) 한 분자의 조효소가 환원된다(수소 첨가). 마찬가지로 amino기 전이 반응에서 pyridoxal phosphate는 2개의 동시적인 반응을 거쳐 제 2의 기질로 작용하며, 각기 다른 α-Keto acid간에 amino기 전이에 대한 운반체로 작용한다.
② 제 2기질의 역할
조효소의 반응에 동등한 역점을 두는 두 번째의 이유는 반응의 이 국면이 실제적으로 보다 큰 기본적인 생리학적 의의를 가질 수 있기 때문이다. 예컨대 pyruvate룰 lactate로 존화시키는 혐기적 상태 하의 근육의 능력의 중요성은 pyruvate나 lactate 그 자체 내에 존재하는 것은 아니다. 이 반응은 단지 NADH를 NAD+로 전화시킬 뿐이다. NAD+없이 해당(解糖)은 계속될 수 없으며 혐기적인 ATP 합성(따라서 근육의 작용)은 중단된다. 요약하면 혐기적인 조건하에서 pyruvate가 lactate로 전화하는 것은 NADH를 재산화하고 ATP의 합성을 가능하게 할뿐이다. 다른 반응들도 위에 못지 않게 동일한 기능을 담당한다. 혐기적으로 성장하는 세균이나 효모에서 pyruvate로부터 직접 유래하는 다수의 물질들이 NADH에 대한 산화제로 사용되고 이 과정에 있어서 그 자체는 환원된다.
③ B-비타민 유도체로서의 조효소
B-비타민은 낳은 조효소의 구조의 일부를 이룬다. 예컨대, 아미노산 대사에 관여하는 여러 효소는 비타민 B₄를 필요로 한다. B-비타민인 nieotinamide, thiamin, riboflavin 및 pantothenic acid는 생물학적 산화, 환원에 필요한 조효소의 구송분이며 folic acid와 cobamide 조효소는 1-탄소 대사에서 작용한다. 특히 현저한 것은 D-ribose와 인삼염에 연결된 adenine 고리의 조효소 구조가 흔히 존재한다는 것이다. 그러므로, 많은 조효소들은 adenosine monophosphate(AMP)의 유도체로 간주될 수 있다.
삼점 부착
여러 기질들은 분명히 효소와 3가지 경합을 한다. 이러한 3점 결합은 대칭성 분자에게 비대칭성을 부여할 수 있다. 각기 다른 3개의 기를 갖는 탄소 원자는 평면적인 효소의 세 지점에 붙게 된다. 평면적인 효소 부위가 한 측면으로부터만 접근될 수 있고 단지 상웅 원자와 부위만이 상호 작용할 수 있으면 분자는 오직 한 방식으로만 결합할 수 있다. 상상적으로 기질 분자를 공간 속에서 돌림으로써 평면 부위의 일면에 대하여 오로지 한 방향으로만 3점 결합을 할 수 있음을 알게 된다. 이 방식의 논리를 연장하면 관학적으로 비활성인 pyruvate 분자의 효소가 촉매 하는 환원이 D, L-이 아니라 L-kactate를 형성하는지를 설명할 수 있다.
효소의 특이성
한 효소가 하나의 특정 반응만을 촉매하고 다른 반응에 근본적으로 개입하지 않는다는 것은 매우 중요한 성질이다. 여러 가지 대사 과정의 속도는 특정 효소의 촉매 능력에 적절한 변화를 일으킴으로써 엄밀하게 조절되는 것이다. 그러나 대부분의 효소들은 구조상 유사성이 있는 몇 개의 기질의 반응 같은 형태를 촉매할 수 있다(인산기 전이, 산화환원 등). 흔히 다른 기질이 고농도로 존재할 때에는 이와 같은 반응이 일어난다. 가능한 반응의 모두가 생물체내에서 일어나는지의 여부는 대체 기질의 세포내 농도의 그 효소에 대한 상대적 친화성이 달려 있다. 효소 특이성의 일반적인 국면에는 다음 것이 포함된다.
① 광학적 특이성
광학적 이성체를 상호 전화시키는 epimerase(racemase)를 제외하고 효소는 일반적으로 기질 분자의 적어도 일부분에 대하여 절대적인 광학적 특이성을 나타낸다. 그리하여 maltase는 α-glycoside의 분해는 촉매 하나, β-glycoside의 그것은 촉매 하지 못하는 반면 Embden-Meyerhof 및 직접적인 산화 회로의 효소들은 D-당인산염의 상호 전황을 촉매 하나 L-당 인산염의 그것은 하지 못한다. 콩팥의 D-amino acid oxidase등 약간을 제외하고 포유 동물 효소의 대다수는 amino acid의 L 이성체에 대하여 작용한다.
다른 생물은 D-amino acid에 대하여 동등한 특이성을 가진 효소를 가질 수 있다. 광학적 특이성은 기질 분자의 일부분 또는 그 전체에 확장될 수 있다. Glycosidase는 이 양자의 극단성에 대한 예를 보여준다. 당과 aclcohol간의 배당 결합의 가수분해를 촉매 하는 이들 효소는 단 성분과의 결합(α 또는 β)레 대하여는 고도의 특이성을 갖지만 alcohol성분 또는 aglycone에 대하여는 비교적 비특이적이다.
② 군 특이성
한 특징 효소는 특정 화학군에 대하여만 작용하는데 glycosidase는 glycoside에 대하여,alcohol 탈수소 효소는 alcohol에 대하여, pepsin과 trypsin은 peptide에 대하여 그리고 esterase는 ester결합에 대하여 각기 작용한다. 그러나 이러한 제한 내에서 다수의 기질이 공격을 받아, 그렇지 않으면 더 많이 소요될지도 모르는 소화 효소의 수를 감소시킨다.
일부 효소는 군 특이성의 보다 높은 차원을 나타낸다. Chymotrypsin은 carboxyl기가 phenylalanine, tyrosine 또는 tryptophan 등의 방형족 amino acid에 기인할 대 그 pedtide 결합을 우선적으로 가수분해한다. Carboxypeptidase와 aminopeptidase는 각기 polypeptide 사슬의 carboxyl-말단 또는 amino-말단으로부터 1회에 하나씩 amino acid를 끊어 낸다.
일부 산화 환원 효소들은 NAD+ 또는 NADP+를 전자 수용체로 동등하게 이용하지만 그 대부분은 그 중의 하나를 우선적으로 사용한다. 폭넓은 총괄로써 포유 동물계에서 생합성 과정(예컨대 지방산 합성)에 작용하는 산화 환원 효소는 환원제로서 NADPH를 사용하는 경향이 있는 반면, 분해 과정에 개입하는 것들은 NAD+를 산화제로서 사용하는 경향이 있다고 할 수 있다. 이따금 한 조직은 그 조효소 특이성에서만 다른 2개의 산화 환원 효소를 가질 수 있다. 그 한 예는 쥐 mitochondria의 NAD+- 및 NADP+- 특이성 isocitrate 탈수소 효소들이다.
간장에 있는 NADP+ 특이성 효소의 약 90%가 mitochondria 밖에 존재한다. 이것은 아마도 생합성 과정에 관련되는데, mitochondria의 NAD+-특이성 isocitrate 탈수소 효소의 분해적 역할을 시사한다. 높은 ADP(낮은 ATP) 수중은 NAD+-특이성 mitochondria 효소를 활성화시킴으로써 citric acid 회로를 통한 단소의 흐름을 조장할 것이다.
효소 활성의 측정
조직 추출물 또는 체액에 극히 미량 들어 있는 효소의 양을 정량 하는데는 보다 일반적인 유기 도는 무기질의 농도를 정량 하는 것과 전혀 다른 문제가 있다. 다행히도 효소의 촉매 활성은 그 자체 측정에 대한 민감하고 특정적인 방법을 제시한다. 조직 추출물 또는 기타 생물학적 액체의 시료에 들어 있는 효소의 양을 측정하기 위하여 시료 속의 효소에 의하여 촉매 되는 반응 속도를 측정한다. 적절한 양에 비례한다. 가능하다면 이 속도는 존재하는 효소의 양에 비례한다. 가능하다면 이 속도는 고도로 정제된 효소의 기지량에 의하여 촉매된 속도와 비교한다.
두 가지가 정확히 비교될 수 있는 조건하에서 그리고 효소 농도가 속도 제한 인자(높은 기질 및 낮은 생성물 농도, 유리한 pH와 온도)인 조건하에서 측정된다면 추출물에 들어 있는 효소의 양이 산출될 수 있다. 그러나 그 속에 들어 있는 효소의 분자수나 질량을 결정하기는 쉽지 않다. 그러므로 결과는 효소 단위로 표시된다. 각기 다른 추출물에 들어 있는 효소의 상대적 양을 이어서 비교한다. 효소 단위는 1분간 반응하는 기질 또는 형성되는 산물의 μmol(1/1000000 mol), ηmol(1/1000000000 mol),picomole(ρmol : 1/1000000000000 mol)등으로 표시된다. 이에 해당하는 국제 효소 단위(IEU)는 μU, ηU, 및 ρU이다.
NAD+(탈수소 효소)가 관련되는 반응에 있어서는 340nm의 파장에서 흡광하는 NADH 또는 NADPH(NAD+ 또는 MADP+는 그렇지 않음)의 성질을 이용한다. NADH가 NAD+로 (또는 그 반대) 변화할 때는 340nm에서의 흡광도가 변한다. 특정 조건하에서 흡광도 변화 속도는 효소 활성에 직접 달려 있다. 첨가된 표준 효소제의 양에 대하여 여러 물매선을 작성함으로써 검정 곡선을 작성한다. 이어서 시료 용액에 들어 있는 효소의 양을 이 표준으로부터 환산해낸다.
① 효소의 연결 분석
상기 예에 있어서 효소 활성을 결정하기 위하여 생산물(NADH)의 형성 속도를 측정하였다. 탈수소 효소 이외의 효소 활성은 생성물의 출현 속도(또는 덜 흔하지만 기질의 소멸 속도)를 측정함으로써 결정하기도 한다. 생성물.기질의 화학적 및 물리적 성질은 정량용으로 어떤 방법을 선택할 것인가를 결정한다. 이들은 때로 거추장스럽기 때문에 한 반응의 생성물을 이 생성물의 기질인 탈수소 효소와 연결시키는 것이 편리하다. 탈수소 효소가 과잉량 존재할 때 NAD(P)H의 출현 또는 소실 속도를 NAD(P)H를 그 기질로 사용하지 않고 효소의 정량에 사용할 수 있다.
효소의 분리
대서경로의 개개의 반응과 화학적 중간 체에 관한 지식 및 촉매 수준에서 작용하는 조절 기전에 관한 지식들은 대부분 정제된 효소의 연구로부터 얻어진 것이다. 사실상 관계되는 효소가 정제되지 않은 대사에 관한 것은 바로 정보가 토막적이고 논란이 많다. 효소의 반응속도론, 조인자, 활성 부위, 구조 및 작용 기정에 관한 믿을 만한 지식도 고도로 정제된 효소를 필요로 한다.
① 친화성 크로마토그래피 법
이 정제법의 특징은 복합적인 단백질 혼합물로부터 한 특정 단백질이나 소수의 특정 단백질들을 선택적으로 제거할 수 있는 능력에 있다. 이 방법의 기초는 정제하고자 하는 효소와 특이적으로 상호 작용하는 고정시킨(불용성화한)ligand를 만드는 데 있다. 단백질 혼합물을 이런 고정시킨 ligand에 폭로시키면 ligand와 강하게 상호 작용하는 단백질만이 결합된다. 원하지 않는 단백질을 제거한 다음 고농도의 용해된 상태의 ligand로 경쟁적으로 추출하여 바라는 단백질을 고정시킨 ligand로부터 특이적으로 용출한다. 이런 방법이 성공적인 경우는 친화성크로마토그라피법으로 성취된 정제는 여러 가지 고전적 방법을 연속적으로 적용시키는 것을 훨씬 능가하고 인상적이다.
효소는 일반적으로 그것의 기질이나 조효소에 대하여 매우 특이적이기 대문에 가장 좋은 ligand는 그 효소의 기질이나 조효소이다. 이것들을 Sephadex 같은 불활성 지지체에 공유결합으로 붙이는 것이 일반적인 방법이다. 그런 부착은 직접 할 수도 있고 3～8개의 탄소 원자 길이를 가진 연결 분자를 통해서 할 수도 있다. ligand의 부착이 효소와의 결합을 방해하면 문제가 생긴다. 친화성 크로마토그라피법을 성공적으로 응용한 예에는 NAD+ 친화성 지지체를 써서 여러 가지 dehydrogenase를 정제한 것이 있다. 많은 dehydrogenase들이 함께 column에 결합되고 또 용해된 NAD+로 처리하면 함께 용출되지만(조효소가 아닌)기질로 용출하면 대부분의 경우 성공적이다.
색소 ligand 크로마토그라피와 소수성 ligand 크로마토그라피도 친화성 크로마토그라피와 매우 상관성이 있는 방법이다. 전자에서는 기질, 조효소나 allosteric effectror의 유사체로 작용하는 유기 색소를 고정된 ligand로 사용한다. 일반적으로 용출은 0.1～1.0M 구배의 NaCl를 사용하여 행한다.
소수성 ligand 크로마토그라피에서는 4～8탄소 길이를 가진 alkyl 사슬을 Sephadex 같은 지지체에 붙인다. 이 alkyl기와 단백질의 소수성 부위 사이의 소수성 상호작용으로 지지체 위애 단백질이 걸린다. 고농도의 염 [예 : (NH4)2SO4]를 함유하는 용액에 녹인 단백질을 지지체 위에 넣은 다음 농도를 차차 낮추면서 같은염 용액으로 용출한다.
② Polyacrylamide Gel(PAGE)법
단백질의 균일성 평가에는 polyacrylamide gel법이 가장 효과적이다. 정제된 단백질을 여러 가지 조건 아래서 전기영동함으로써 순도를 평가할 수 있다. 충분한 양의 시료를 칠한다면 변성되지 않은 단백질의 1차원 PAGE gel에서의 많거나 적거나 단백질 혼합물의 존재를 판별할 수 있다. 2차원(O'Farrell) PAGE에서의 일차원에서는 단백질을 요소와 중합된 양성 전해질로 유지시킨 pH 구배를 함유하는 전장에서 평형에 달하게 함으로써 pI 값에 따라 변성된 단백질을 분리한다. 이차원에서는 SDS로 변성시킨 다음 promoter의 분자량에 따라(존재한다면) 단백질을 분리한다.
효소의 세포내 분포
“효소의 주머니”라는 세포에 대한 원래의 개념은 세포내에서 효소, 기질 및 조인자의 공간적 배치와 구획화가 가진 절대적 의의의 인정으로 대체되었다. 가령 쥐의 간장 세포에서 해당 과정의 효소는 세포질의 비특정 부위에 존재하지만 citric acid 회로의 효소는 mitochondria내에 들어 있다.
세포 소기관 어디에 어떤 효소가 분포되어 있느냐 하는 것은 고속 원심 분리로 세포 균질액을 분획한 다음 각 분휙중의 효소 함량을 측정함으로써 연구된다.
비교적 변질되지 않은 상태에 있어서 조직 또는 세포 내의 특징 효소 활성에 대한 국제는 흔히 조직 화학적 방법(“조직 효소학”)에 의하여 달성된다. 저온 microtome으로 제작한 조직의 엷고(2～10μm) 냉동된 부위를 특정 효소에 대한 기질로 처리한다. 효소가 존재하는 부위에서는 효소가 촉매한 반응의 산물이 형성된다. 생성물이 착색되고 난용성이라면 그것은 형성 부위에 잔류하고 효소 국제에 대한 표지물 구실을 한다. 비록 정량적으로 믿을 만한 기술은 완성되지 못하였지만 “조직 효소학”은 비교적 효소 분포도의 도식적 및 생리적 양상을 제시한다. 만족스러운 조직 화학법이 이용 가능한 효소에는 acid 및 alkaline phosphatase, monoamine oxidase 및 여러 가지 탈수소 효소 활성이 포함된다.
Isozyme
“Malate dehydrogenase"나 ”glucose-6-lhoslhatase"와 같은 낱말은 어떤 단일한 촉매작용의 실체를 기술하는 한편 malate를 oxaloacetate로 산화시키거나 후자는 glucose-6-phosphate를 glucose와 Pi로 가수분해하는 것을 촉매 하는 모든 단백질을 전보 가리키는 일반적인 명칭이기도 한다. 1930년대에 예로 malate dehydrogenase를 다른 근원(예 : 쥐 간과 E.coli)에서 정제하였을 때 쥐 간이나 E.coli의 malate dehydrogenase는 둘 다 같은 반응을 촉매하나 그 단백질의 물이, 화학적 성질은 크게 다르다는 것이 명백해졌다.
그러나 같은 촉매 작용을 가졌으나 물리적으로 다른 형의 효소가 같은 생물의 다른 조직, 같은 조직중의 다른 형의 세포 또는 E.coli 같은 무핵세포에까지도 존재할 수 있다는 것이 일반적으로 받아들여진 것은 1950년대 후반의 일이다. Hemoglobin에 전기영동적으로 서로 다른 형이 있다는 것을 증명하기 위하여 개발된 전기영동분리법이 특정 효소 활성을 가진 전기영동상 다른 형을 분리하는 데 응용됨으로써 이와 같은 사실이 증명되었다.
기본적으로 “isozyme(isoenzyme)"이라는 용어는 위 예와 같이 일정한 촉매작용을 가졌으나 물리적으로 서로 다른 형의 효소 전부를 나타내는 데 사용된다. 실제로는 특히 임상의학에서는 isozyme이란 더 제한된 의미를 갖는다. 즉 인체와 같은 특정 유핵생물의 여러 세포형에 존재하는 어떤 효소로서 물리적으로 서로 다르고 또 분리할 수 있는 형들을 의미한다. isozyme은 척추동물의 혈청이나 조직, 곤충, 식물 그리고 단핵생물에 흔히 있다. 여러 가지 dehydrogenase, sxidase, transaminase, phosphtase, transphosphorylase 및 단핵 분해 효소의 isozyme이 보고되어 있다.
인체 혈청은 몇 개의 젖산 탈수소 효소 isozyme을 함유하며, 그 상대적인 비율이 어떤 병적 조건하에서 크게 변동한다는 1957년도의 발견에 의하여 isozyme에 대한 의학적 관심이 자극을 받게 되었다. Isozyme은 비단 포유 동물의 혈청과 조직에서뿐만 아니라 양서류, 조류, 곤충, 식물, 그리고 단세포 생체에서도 보고된 바 있다. 관련된 효소의 종류와 수는 다같이 동등하게 다양하다.
수많은 탈수소 효소 그리고 몇 가지의 산화 효소, transaminase, phosphatase, transphosphorylase, 및 단백질 분해 효소의 isozyme들이 보고된 바 있다. 혈청 젖산 탈수소 효소 isozyme은 전분, 한천 또는 polyacrylamide gel을 사용하고, 일반적으로 pH 8.6애서 혈청 시료를 전기 영동법으로 처리함으로써 알게 된다. Isozyme은 이 pH에서 각기 다른 전하를 가지며, 이 전기 영동도에서 5개의 각기 다른 부위로 이동한다. Isozyme은 이어서 무색의 염료를 착색 염료로 환원하는 촉매 능력으로 그 이동 위치를 알 수 있다.
전형적인 탈수소 효소 반응의 시약에는 다음의 것이 포함된다.
㈎ 환원된 기질(예 : 젖산)
㈏ 조효소(NAD+)
㈐ 산화된 염료(예 : nitroblue tetrazolium염 [NBT])
㈑ NADH와 염료간에 전자를 수송할 수 있는 중간 전자 수송체(예 : phenazine methosulfate[PMS])
㈒ 필요하면 이온을 활성화할 수 있는 완충 용액
젖산 탈수소 효소는 젖산명으로부터 NAD+에 2개의 전자와 1개의 H+를 이전하는 것을 촉매 한다. 이 반응은 젖산 탈수소 효소의 효소 촉매물의 존재하에서만 측정할 수 있는 속도로 진행한다. 실험 혼합물의 전기 영동 물질에 고루 펼쳐지고 37℃로 온도가 가해질 때 전자 이전 반응은 젖산 탈수소 효소가 존재하는 부위에서만 집중적으로 일어난다. 이 대(帶)들은 육안으로도 볼 수 있으며 그들의 상대적인 강도는 적절한 전기 영동 photometer에 의하며 적절히 정량될 수 있다. 전기 영돈상(像)에서 검출되는 가장 음성적인(이동도가 가장 큰) isozyme은 I1이다.
젖산 탈수소 효소 isozyme은 4차 구조에서 서로 다르다. 활성적인 젖산 탈수소 효소 분자(분자량 130,000)는 H와 M(분자량이 약 34,000)의 두 가지 형태의 4개 분단위로 구성된다. 오로지 4분단위로 된 부자만이 촉매 활성을 갖는다. 그 차례가 중요치 않다면 이들 분단위는 다음과 같은 5개 방법으로 결합될 수 있다.
HHHH
HHHM
HHMM
HMMM
MMMM
C.L.Markert는 젖산 탈수소 효소 isozyme간의 관계를 구명하기 위하여 4차 구조를 방해하고 또 재생하는 것으로 알려진 조건을 사용하였다. 젖산 탈수소 효소-I1의 해리와 재형성 또는 젖산 탈수소 효소-I5의 그것은 새로운 isozyme을 생성하지 못한다. 그러므로 이들은 그 각개가 단 하나의 분단위 형태로 구성된 것이 정제된 젖산 탈수소 효소-I1과 젖산 탈수소 효소-I5의 혼합물이 동일한 처리를 받으면 젖산 탈수소 효소 -I2, -I3, 및 -I4가 동시에 형성된다. 발견되는 isozyme의 개략적인 비율은 다음과 같은 관계가 존재할 때 나타나는 것과 동일한 것으로 밝혀졌다.
H와 M 분단위 합성은 각기 다른 유전자에 의하여 조절되는 것으로 증명되었다.
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