일반생물학실험 | Expression of recombinant α-synuclein gene

 

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) BL21의 transformation을 시행한 후 배양시킨 배지로부터 E.coli colony를 따서 LB+Amp liquid Media 25㎖에 접종하여 suspension culture를 했다. overnight culture를 한 후 LB+Amp liquid media 325㎖에 부었다. OD를 측정하기 위해서는 처음에 박테리아가 없는 것을 0으로 잡고 우리가 접종하여 키우던 것을 큐벳에 넣고 흡광도를 측정하면 된다.

 

2) 처음에 OD가 0.1이었고 2시간 후 0.2였다. 37℃에서 좀 더 culture하여 1시간 후 OD가 0.6가 되었다. 이 때 1mM의 IPTG 350㎕(1mM)를 넣은 후 15℃에서 8시간 동안 induction을 시킨다. 이 과정에서 IPTG의 농도나 배양 시간 등이 gene expression에 영향을 줄 수 있다.

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3) IPTG로 induction시킨 용액 이외에도 IPTG가 없을 때는 어떤 발현이 나타나는지 알아보기 위해 No IPTG 용액을 준비한다. 세포 200㎕를 각 조 튜브에 14000rpm 3초후 멈춘 후 supernatant를 빼낸다. 1x buffer를 넣고 깨준 후 10분 끓인다. 수증기로 있는 것들을 다운시키기 위해 식힌 후 4℃에서 13000rpm으로 centrifuge 해준다.

 

4) IPTG induction한 용액을 준비한다. Sonication을 통해 cell 내용물이 buffer안으로 녹아 나오게 해야 한다. Sonication 할 때 cell이 에너지에 의해 깨지므로 cell density를 높이는 작업이 필요하다. 펠렛을 만들어 얼린 후 깬다. 배양을 마친 cell 15㎖를 넣고 resuspension과정을 거쳤다. 얼음에서 잠깐 incubation한 후 거품은 버리고 폴리프로필렌 통에 옮긴다. cell 15㎕, 5x buffer 10㎕, PBS를 넣고 끓여서 Induction한 샘플을 만든다.

 

5) 준비된 Ni-NTA agarose bead가 50% slurry상태로 있다. 여기서 bead solution을 20㎕ 뽑아서 10초 centrifuge해주고 DW 500㎕을 넣은 후 흔들어주고 다시 centrifuge해준다. 그다음 100㎕정도 lysis buffer를 넣고 resuspension하여 쓰면 된다. 이 lysis buffer는 pH가 7.4이며 PBS와 1% NP-40, 1mM PMSF로 구성되어 있다. Cell sonication후에 여러 단백질이 나올텐데 그 중에 protease도 있을 것이다.

 

6) Rotamix를 2시간 시행 후 후 wash buffer를 500㎕씩 넣고 gently inverting 해준다. 이 wash buffer는 pH8.0이고40mM Imidazole이 들어있다. Imidazole은 Ni-NTA에 binding된 His-tag를 elution시키는 역할을 한다. 그 다음 centrifuge해주고 상층액은 버린다.

 

7) elution buffer 20㎕을 넣고 voltexing한다. 그 다음 soup을 뽑은 후 elution buffer 30㎕을 rotamix 30분을 시행한다. Centrifuge 한 후 파이펫 팁을 자르고 10짜리 작은 팁을 꽂고 뽑아내어 elution한다. 다시 elution buffer 20㎕ voltexing, soup 뽑고 elution buffer 30㎕넣은 후 rotamix 1시간 하고 centrifuge하여elution한 후 또elution bufferelution buffer 20㎕넣고 voltexting, soup 뽑고 rotamix 30분 시행 후 centrifuge한다.

 

8) Induction한 cell 150㎕와 buffer㎕로 Sample buffer 만든다. 5x sample buffer 9㎕와 elute 36㎕, 총 45㎕를 voltexing한 후 3분간 끓이고 Centrifuge한다. 이렇게 하면 bead와 붙은 결합이 끊어지게 된다.

 

9) SDS-PAGE는 많은 시료를 로딩하더라도 좋은 해상도로 얻을 수 있다는 장점이 있다.

 

 

 

[일반생물학실험]Expression of recombinant α-synuclein gene 레포트