생화학실험 | RNA 추출 & cDNA 합성

 

 

 

TIP

 

 

세포에서 직접 RNA를 추출하여 보고, 추출된 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하여 RT-PCR을 통해 특정 유전자의 mRNA 발현량을 비교한다.

 

 

 

Chloroform의 역할

RNA extraction을 할 때 페놀계열 lysis buffer를 쓰게 되는데, 이후 chloroform을 넣어줌으로써 RNA가 녹아있는 수층의 페놀을 제거하여 RNA의 순도를 높여준다. pH4 정도로 낮을 때 RNA는 물과 함께 섞여있으므로 물에 남아있을 수 있는 페놀을 chloroform에 녹아들게끔 해주는 것이다. 또한 chloroform은 비극성용매여서 물에 잘 녹지 않으므로 층분리가 이루어지게 된다.

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실험 방법

1. RNA extraction

1) 500㎕ RiboEx를 넣은 sample에 chloroform 100㎕를 넣어준다.

 

2) vortexing 해준 후 2분 정도 대기한다.

 

3) 13000RPM 4℃에서 8분간 centrifuge 돌려준다.

 

4) 상층액 200㎕를 새 microtube에 넣어준다.

 

5) RBI 200㎕를 첨가한 후 inverting한다.

 

6) 350㎕를 따서 column에 넣어준다.

 

7) centrifuge 13000RPM, 4℃, 1min

 

8) SWI 500㎕를 column에 넣어준다.

 

9) centrifuge 13000RPM, 4℃, 1min

 

10) RNW 500㎕를 column에 넣어준다.

 

11) centrifuge 13000RPM, 4℃, 1min

 

12) 에탄올을 확실히 제거하기 위해 centrifuge 13000RPM, 4℃, 2min

 

13) 새 microtube에 column을 옮겨준다.

 

14) 30㎕ DEPC를 cloumn에 넣고 2분간 기다린다.

 

15) centrifuge 13000RPM, 4℃, 2min

 

16) Nanodrop을 이용하여 RNA 양을 정량한다.

 

2. cDNA synthesis

1) 정량한 RNA 500ng를 random hexamer, dNTP와 혼합한다.

 

2) 혼합물을 65℃에 넣고 5분간 기다린다.

 

3) 혼합물에 Reverse transcriptase, 5x buffer, RNase inhibitor를 첨가.

 

4) 상온에서 10분간 대기한 뒤에 50℃에서 1시간 동안 반응시킨다.(tube내 증발이 일어날 수 있기 때문에 30분 간격으로 tappin-spindown을 진행)

 

5) 반응이 완료된 cDNA D.W 80㎕를 첨가, 희석하여 연구에 사용한다.

 

 

 

[생화학실험]RNA 추출 & cDNA 합성 레포트