일반생물학실험 | Lycopene 배양 및 추출

 

 

 

발효와 부패의 차이

발효는 미생물의 작용에 의해 유기물이 분해되어 사람에게 유용한 물질이 생성되는 현상이다. 특정한 조건(온도, 시간, 무산소상태)에서만 발효가 일어나며, 발효균은 초산과 젖산, 알코올 등 좋은 효소를 분비하여 유해균을 무력화시킨다. 발효를 이용하여 만든 음식은 대표적으로 치즈, 요구르트, 막걸리, 와인, 맥주, 김치 등이 있다.

 

부패는 생물의 유해나 배설물 등 질소를 함유하는 유기물질이 혐기성 세균에 의해 불완전하게 분해되는 현상이다. 혐기성 세균에 의해 유기물질이 펩톤, 아미노산 등으로 분해되면서 아민, 황화수소가스, 암모니아가스, 메탄이 형성되어 악취가 풍기고 유해한 독성 물질이 발생한다.

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실험 방법

1. lycopene 배양

1) 배양조건을 확인하고 배지를 만든다.

 

Strain	DH5α(pT-LYCm4/pSNA) – lycopene strain
Condition	50㎖ 2YT medium (Amp, Cmp) 2% Glycerol, 0.2% arabinose 30℃250rpm
Sampling	50hour sampling

 

2) O.D 600㎚ 0.1로 접종한다.

 

3) 48h 후에 O.D와 pH를 측정한다.

 

2. O.D 측정

1) cuvette에 main culture 50㎕, 증류수 950㎕을 담고, e-tube 2개에 50㎕씩 담아준다(추출용)

 

2) 600㎚에서 흡광도를 측정한다. (20배 희석했으므로 원래는 측정값에서 20배를 곱해줘야 하지만 이 기기에서는 20배 곱한 값으로 나온다.)

 

3. pH 측정

1) pH기기를 보정한다.

 

2) pH 측정기기에 main culture 배양액 150㎕을 담는다.

 

3) 측정 후 기기를 닦아준다. (유리가 깨지지 않게 유의)

 

4. Lycopene Extraction

1) 배양액 50㎕을 e-tube에 넣는다.

 

2) e-tube에 넣은 cell을centrifuge(13000rpm 2min)로 cell down 시킨다.

 

3) paper towel을 깔고, e-tube를 털어서 배지를 가볍게 제거한다.

 

4) 물 500㎕을 이용하여 washing 후 다시centrifuge(13000rpm 3min)로 cell down 시킨다. Washing할 때 rack에 e-tube를 긁어주면 pellet이 더 잘 풀린다.

 

5) 물을 제거한 후e-tube 벽면의 물기(소량)를 약 10초간 spin down 한다. Cell을 풀어줘야 하기 때문에 e-tube 바닥 쪽에 있는 선까지 물을 남겨둔다,

 

6) vortexing하여 표면적이 넓어질 수 있도록 cell을 풀어준다. 충분히 잘 풀어주어야 추출이 잘된다.

 

7) 한 손으로 vortexing하면서, 다른 손으로는 Acetone 400㎕를 준비한다. 완전히 잘 풀어진 cell에 Acetone을 넣고 바로 vortexing 해준다. (빠르게, 충분히)

 

8) cell이 깨질 수 있도록 3～5초간 sonication해준다. Cell이 깨지고 나면, 빛에 약하므로 은박지로 싸준다. (lycopene: 빛에 의해 분해됨)

 

9) e-tube를 꽂은 rack을 은박지로 싸서 55℃ 15min incubation한다.

 

10) 충분히 vortexing 해주면서, Acetone 600㎕을 추가로 넣어준다.

 

11) (sonication없이) 다시 한번 55℃ 15min incubation해준다.

 

12) vortexing 해준 후, centrifuge 13000rpm 10min 한다. Down 된 cell(pellet)이 흰색이 되어있어야 한다.

 

13) 상층액 500㎕을 새 e-tube에 옮겨 담은 후 바로 475㎚에서 O.D를 측정한다.(lycopene 흡광도: 475㎚)

 

14) lycopene 정량 분석한다.

 

 

 

[일반생물학실험]Lycopene 배양 및 추출 레포트