생명과학실험 | Simple tandem repeat를 이용한 인간유전형 분석

 

 

 

개인은 동일한 형태인 상동염색체라 하는 chromosome을 1쌍씩 가지고 있다. 여기서 같은 function을 갖는 유전자는 한 위치에 일정하게 존재하는데 이것을 locus라고 한다. 상동염색체는 한 쌍의 유전자이기 때문에, 개인의 형질을 결정하는 locus는 각 한 개씩 두 개가 있다. 이 두 개의 locus에 있는 유전자를 합쳐서 allele라 한다. 이 allele는 개인마다 서로 차이를 가지므로 이러한 차이를 집단크기로 분석하여 allelic variation을 조사할 수 있다. Allelic variation을 간단하게 조사하는 데에는 STR(simple tandem repeat)을 이용하는 방법이 있다.

 

STR은 DNA에서 2개 이상의 nucleotides나 simple sequences가 repeat되는 부위를 말하며, 2개에서 50개까지의 base pairs정도의 길이를 가지고 주로 amino acid정보를 가지고 있는 exon보다는 유전정보를 갖고 있지 않은 intron에 존재한다. 이 부위의 repeat되는 수가 allele에 따라 다르기 때문에 이를 분석해 allelic variation을 조사할 수 있다. 사람은 여러개의 염색체를 갖고 있고 그 안에 또 여러개의 DNA를 갖고 있다. 이 중에 원하는 것을 구별하여 살펴보기 위해 PCR을 사용한다. PCR(Polymerase Chain Reaction)은 1984년 Mullis와 Faloona가 처음으로 개발한 방법으로 DNA중합효소에 의한 DNA복제의 특징을 이용해 특정한 DNA Sequence의 copy수를 증폭시키는 기술이다.

 

여기서 사용되는 DNA 중합효소에는 Klenow polymerase와 Taq polymerase가 있다. Klenow polymerase는 열에 약해 매 주기마다 효소를 새로 넣어 주어야 하고 생성물의 최대 길이가 400bp인 반면, 1988년 발견된 고온의 온천수(72-74℃)에서 서식하는 미생물인 Thermophilus aquaticus에서 분리한 Taq polymerase는 95℃의 고온에서도 잘 버티기에 더 많이 이용된다. PCR에는 3개의 단계가 있다. 첫 번째는 DNA denaturation으로, 이중가닥으로 이루어진 DNA를 가열시켜 단일가닥의 DNA로 분리시키는 단계이다. 여기서 가열시키는 온도가 높을수록 DNA가닥이 잘 분리되지만 Taq polymerase가 아주 고온에서는 변성될 수 있으므로 보통 92℃～95℃의 온도에서 한다. 두 번째는 primer annealing단계이다. single strand로 분리된 DNA가 template역할을 하고 특정 sequence의 base에 상보적으로 primer가 binding하는 단계이다.

 

DNA가 상보적인 base를 갖는 single strand 2개이므로 여기에 맞는 primer 또한 sense와 antisense primer 두 종류를 사용한다. 여기서 온도를 정하는 것은 매우 중요한데, 너무 높은 온도에서는 primer가 DNA에 약하게 결합하므로 증폭된 DNA의 product 양이 적어지고 너무 낮은 온도에서는 primer가 아무 곳에나 결합하기 때문에 원하지 않는 DNA가 증폭될 수 있기 때문이다. 보통 50~65℃(Tm)에서 진행한다. 세 번째 단계는 elongation이다. 이 단계에서 Taq polymerase가 template DNA에서 DNA를 합성한다.

 

이 단계에서 보통 70℃～74℃ (최적은 72℃)에서 진행하며 PCR product 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 이 단계의 시간을 연장한다. Taq polymerase는 보통 1분에 2,000-4,000 base pair를 중합하므로 만들어지는 PCR product의 크기 1kb마다 1분정도 시간을 배당하여 생각하고 시간을 짠다. 보통 이러한 3단계를 30~40회 반복하며, cycle 수의 2의 제곱승으로 PCR product가 만들어진다. 이 PCR방법에 의해 특정 STR을 포함하는 DNA를 증폭시키면 각 allele의 STR부분 repeat수가 다르므로 서로 다른 길이의 PCR product가 생성된다.

 

이 PCR product를 PAGE(poly acrylamide gel electrophoresis)으로 분리시켜 분석할 수 있다. PAGE는 전기장에서 Polyacrylamide gel이 만드는 좁은 격자구조를, size가 작은 물질이 큰 물질보다 더 잘 빠져나갈 수 있기 때문에 (-)charge인 DNA가 size가 작을수록 더 빠른 속도로 (+)electrode로 이동하는 것을 이용해 DNA fragments나 protein을 크기별로 분리할 때 쓰이는 방법이다. 이렇게 분리된 DNA들은 gel상에서 보이지 않으므로 DNA에 끼어들어가 UV를 쬘때 발광하는 EtBr을 처리해 주면 개인의 allele를 볼 수 있고, 이를 분석하여 집단의 allelic variation을 조사할 수 있다.

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실험 방법

1. PCR

1) Lysis buffer를 만든다.

 

 

2) 머리카락을 모근이 붙어있는 상태로 4～5개 뽑은 후 모근 부분을 약 5㎜ 정도를 tube에 넣는다. (다른 사람의 것과 섞이지 않도록 주의한다.)

 

3) Centrifuge에 banance를 맞춰서 넣은 뒤, 머리카락이 tube의 아래 부분으로 내려갈 수 있도록 돌려준다.

 

4) 머리카락이 담긴 tube를 볼텍스 믹서 위에 가볍게 올린 후lysis buffer를 10㎕씩 tube에 넣어준다.

 

5) Tube를 95’C에서 20분간 heating한다.

 

6) PCR Master mix를 만든다.

 

 

7) 20분간 heating이 끝나면 머리카락이 든 tube에 HEPES 5㎕씩 넣고 볼텍스 믹서에 10초간 shaking해준다. 그리고 centrifuge에 tube를 넣고 5분간 돌려준다.

 

8) PCR Master mix의 pH를 검사해 준 후, tag polymerase 0.16㎕를 PCR Master mix에 넣어준다.

 

9) PCR Master mix를 볼텍스 믹서로 shaking해준다. 그리고 centrifuge에 tube를 넣고 1회 spindown해준다. 그 후 PCR Master mix를 각각 PCR tube에 18㎕씩 담는다.

 

10) PCR tube에 머리카락이 든 tube의 용액을 2㎕씩 담는다. 그리고 각 PCR tube 마다 맞는 이름을 쓰고 볼텍스 믹서에 shaking 해준다. (머리카락이 PCR tube에 같이 딸려 들어가지 않도록 주의 한다.)

 

11) PCR tube를 PCR를 해준다.

 

2. PAGE

1) 20% Acrylamide gel을 만들고 30분간 굳혀준다.

 

 

2) Gel electrophoresis apparatus에 gel을 끼운다.

 

3) Buffer를 Gel electrophoresis apparatus의 두 gel사이에 가득 부어준다.

 

4) Comb를 뽑고 gel에 marker와 PCR product를 5씩 loading한다.

 

5) 200V에서 2시간동안 running한다.

 

6) Gel electrophoresis apparatus를 끄고 gel을 떼어낸다.

 

7) EtBr in 1X TBE에서 10분간 staining한다.

 

8) Gel doc을 이용하여 staining된 gel을 찍는다.

 

 

 

[생명과학실험] Simple tandem repeat를 이용한 인간유전형 분석 레포트