임상화학실습 | Biuret 법

Biuret 법

뷰렛반응 시약 속에는 2가의 구리이온(Cu²⁺)이 들어 있기 때문에 푸른색을 띤다. 시약이 단백질과 만나면 보라색으로 색이 변하는 성질을 이용하여 단백질의 검출에 사용한다. 색이 변하는 이유는 펩티드결합이 두 개 이상 존재하는 구조를 뷰렛이라 하는데, 이 뷰렛구조가 2가의 구리 이온과 반응하여 보라색의 착화합물을 형성하기 때문이다. 모든 단백질은 기본적으로 무수히 많은 펩티드결합으로 이루어져 있기 때문에, 뷰렛반응으로 검출할 수 있다. 단백질 뿐 아니라 단 몇 개의 펩티드결합을 가지고 있는 펩티드도 검출할 수 있다.

 

두 개 이상의 펩티드 결합을 가지고 있는 화합물들은 알칼리성 용액에서 묽은 황산구리로 처리하면 자주색을 띠는 물질을 생성한다. 색깔은 구리 원자와 두 개의 펩티드 사슬에서 오는 네 개의 질소원자들 사이에서 배위화합물이 형성됨으로써 생기는 것으로 생각되고 있다. 뷰렛 시험은 모든 단백질에 대해서 재현성이 꽤 좋으나 비교적 많은 양(1～20㎎)의 단백질을 정량하는 데 쓰이는 방법이다. 또한, 뷰렛은 CuSO₄ 알칼리성 와 반응하여 보라색의 착화합물을 만든다.

 

두 개 이상의 펩티드 결합을 화합물도 마찬가지로 유사한 착화합물을 만들며 단백질의 경우에는 청자색 또는 적자색을 나타낸다. 이 원리를 이용하여 단백질을 정량한다. 보통 이 방법으로는 약 1～10㎎의 단백질을 정량할 수 있지만, 미량 뷰렛법은 약 0.25～2.0㎎까지 정량할 수 있는 감도를 가진다. 착화합물의 색은 1～2시간동안은 안정하지만, 그 이상의 시간에서는 점점 색도가 증가한다.

 

 

실험 방법

1. 측정조작법

1) 시약과 검체 준비

① 정색시약과 총 단백 표준액, 검체 3종류 준비

② 채혈 : 팔을 묶어 혈관이 도드라져 보이도록 한 후 니들을 꽂는다.

③ 10분간 방치

④ 원심분리기 → 위에 뜬 혈청을 Test 3 검체로 사용

 

2) 총 단백 측정

① 정제수, 표준액, 혈청, 정색시약(뷰렛시약)

 

 

② 맹검 : blank- 뷰렛시약, 증류수 집어넣음 → 뷰렛시약에 아무런 변화가 없다.

③ 스탠다드 : 일정 양의 시약과 표준물질이 들어간다.

④ 테스트 1 : 총단백량 알고있다

⑤ 테스트 2 : ”

⑥ 테스트 3 : 채혈해서 원심분리한 것. 채혈을 해서 혈액을 부으면 겔은 밑에 있다. 원심분리를 하는 동안 겔이 변성하며 셀 층과 혈청 층 사이에 겔이 낀다. 셀이 혈청 층으로 이동하지 않게 막아준다.

⑦ 각 튜브에 시약을 5㎖, 표준액과 검체 0.05㎖(50마이크로) 집어넣는다.

⑧ 30분정도 지난 후 분광 광도계로 흡광도 측정.

⑨ 뷰렛시약과 검체에 들어있는 단백질이 만나서 짙은 청자색으로 변한다.

⑩ 이것을 분광 광도계로 540㎚의 파장에서 흡광도를 측정한다.

 

 

 

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