기기분석실험 | HPLC - Benzene, Toluene, Xylene의 분석

 

 

 

TIP

 

 

HPLC의 이론 및 기기조작을 통하여 혼합 액상의 성분을 분석하고 크로마토그래피의 원리를 이용하여 시료의 정량, 정성 분석 방법을 익힌다.

 

 

 

크로마토그래피법은 1903년 러시아의 식물학자 Michael Tswett에 의하여 처음으로 개발되었다. 최초의 크로마토그래피는 탄산칼슘 분말을 채운 유리관에 클로로필과 식물성 염료를 주입하고 석유에테르 같은 용매를 흘려주어 분리하는 형태였다. 크로마토그래피라는 명칭은 그리스어 chroma(색)와 graphien(쓰다)으로부터 유래하였다.

 

이후 크로마토그래피법은 점차 발전하였으며 1941년에는 영국의 Martin과 Synge에 의해 액체-액체 크로마토그래피법이 확립된다. 최신의 액체 크로마토그래피는 1960년 중반 이후부터 등장하였는데, 이 최신 액체 크로마토그래피는 분리 성능이 좋고, 분리 시간이 빠른 대신 높은 압력이 요구되어 고성능 또는 고압 액체 크로마토그래피(high preformance or high pressure liquid chromatography, 이하 HPLC)라 부르고 있다. 현재 기체 크로마토그래피와 HPLC는 많이 사용되고 있는 분석기기로서 분석 분야에서 중요한 위치를 차지하고 있다.

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실험 방법

1. 실험 과정(HPLC 환경마다 다름)

1) 본체 밑에 전선을 접지시킨다.

 

2) Autochro icon을 click한다.

 

3) 새 파일 열고 Ch.2를 잡고 분석 시료 5개로 잡은 후 확인 버튼을 누르면 크로마토그래피 화면이 뜬다.

 

4) 5개의 시료 이름을 정해주고 화면 오른쪽의 기기쪽 start 신호를 check해 준다.

 

5) module의 전원 모드를 켠다.

 

6) detector의 power를 켠 후 pump의 power를 켠다.

 

7) pump의 enter를 누르면 숫자 조절이 가능하다. 보통 flow rate 1.8 ㎖/min으로 실험을 하는데 한번에 1.8 ㎖/min까지 올리면 tube에 기포가 발생하고 기기가 망가질 수도 있다. 따라서 0.2 ㎖/min씩 단계적으로 올린다. 우선 flow rate을 0.2 ㎖/min으로 해 놓고 start button을 눌러준다. 그리고 steady state 상태가 되면 enter 누르고 0.4 ㎖/min으로 올려 주고 enter 누른 뒤 다시 enter 누르고 0.6 ㎖/min으로 올려준 뒤 이렇게 단계적으로 1.8 ㎖/min까지 올려준다.

 

8) 4와 6 button의 화살표 중 6 button을 눌러 기기창의 아래줄로 내려간다. 그 다음 clear button을 눌러주면 조건들이 바뀌는데 pressure 값이 나오게 한다. run lamp가 깜박거리면 압력이 올라가고 있으므로 s.s가 아닌것이다. 이때는 실험을 수행하면 안 된다. run lamp가 깜박임을 멈추면 s.s이다. 종종 pressure값이 안 올라가는 경우가 있다. 그것은 기포가 있기 때문이다. 그때는 prime/purge에 주사기를 꽂고 왼쪽으로 돌려 약간 열어준 후 주사기로 기포를 빼낸다. 그리고 다시 닫아주면 pressure가 올라간다. 보통 pressure는 2000 psi까지 올라간다.

 

9) 시료를 만든 후 load 상태로 두고 시료가 든 마이크로 실린지를 찔러준다. 그리고 실린지에 들어 있는 시료를 넣어준다. 그러면 시료가 내부에서 대기하고 있는다.

 

10) 시료를 넣어주면 detector의 absorbance값이 계속 변한다. detector의 0 button(auto zero)을 누르면 absorbance값이 0이 된다. 0이 되는 순간에 inject로 돌려준다. 그러면 시료가 tube로 들어간다. 수집이 다 된 다음에 다시 load로 해 놓는다.

 

11) peak가 나왔으면 수집 중지 button을 누른다. 그리고 load로 해 놓은 다음 실린지를 빼 준다.

 

12) 해당 시료의 번호를 click하면 그 부분만 까맣게 된다. 그런 후 적분 button을 누른다. 그러면 그래프가 나타나는데 인쇄 button을 누르고 확인을 누르면 된다.

 

13) 까맣게 지정된 것을 풀어주고 다음 시료를 넣어야지 다음 시료의 결과가 나온다.

 

14) 5개의 시료 중 보고 싶은 것 2개가 있다면 나머지 3개의 시료 종류를 미지로 하고 2개 는 표준으로 한 후 보기의 peak의 다중 보기를 누른다.

 

15) flow rate를 처음과 반대로 단계적으로 0까지 내린 다음 pump power off, detector power off, module power off한다.

 

2. 시료 만드는 법

1) Benzene, Toluene, Xylene를 각각 400 ppm의 농도로 만든다.

① Acetonitrile(용매) 10 ㎖ + B 4 μl

② Acetonitrile(용매) 10 ㎖ + T 4 μl

③ Acetonitrile(용매) 10 ㎖ + X 4 μl

④ 400 ppm B 1 ㎖ + 400 ppm T 1 ㎖

⑤ 400 ppm B 1 ㎖ + 400 ppm T 1 ㎖ + 400 ppm X 1 ㎖

 

2) 시료 주입은 각각 30 ㎕씩 한다.

 

 

 

[기기분석실험]HPLC - Benzene, Toluene, Xylene의 분석 레포트