알고자하는 조직 내 특정물질을 항원-항체반응을 이용하여 특이적으로 검출한다.
면역 조직 화학적 검사
항원과 항체간의 반응을 이용하여 세포나 조직 내에 존재하는 물질을 확인하는 면역염색법이다. 면역조직화학적 염색의 발전은 면역형광법의 개발로 활성화 되었다. 면역 형광법은 형광색소를 부착시킨 항체를 조직절편에 부착시키고 완충액으로 세척하면 항원과 선택적으로 결합한 항체만 남게 된다. 이러한 방법으로 염색한 조직절편을 형광현미경으로 관찰 하면 자외선에 의하여 형광색소가 형광을 나타내게 되므로 항원과 항체가 결합한 부위에서 양성반응을 확인할 수 있다.
그러나 면역 형광법은 냉동조직절편을 사용해야 하고 분해능이 떨어지며 음성반응을 보이는 세포나 조직학적 구조를 관찰할 수 없어서 진단 및 연구에 쉽게 이용하기는 어려웠다. 그 이후로 면역조직화합법의 효시가 된 과산화효소를 이용한 효소항체법이 최초로 개발되었고, PAP(Peroxidase Anti-Peroxidase)법이 개발되었다.
PAP법은 파라핀절편의 이용이 가능하고 염색 표본을 장기간 보존할 수 있게 되어 임상에서 광범위하게 이용되기 시작하였으며, 그 후 Protein A법과 ABC (Avidin-Biotin Conjugae)법이 개발 되었다. 면역조직화학적 검사를 이용하여 검출하는 항원은 분자량이 5,000정도인 단백, 다당류, 핵산 등의 고분자 물질이다. 항원에는 항체를 식별하는 특정한 부위가 있는데, 이를 항원 결정부위 (epitope)라고 부르며 분자량 5,000에 대하여 한군데가 있는 것으로 알려져 있다.
즉, 분자량 이 20,000이면 4개 정도의 항원 결정부위가 있다. 항원에 결합하는 항체는 혈청내의 면역글로블린(Immunoglobulin, Ig)이라 부르는 단백질에 존재한다. 면역조직화학에 이용되는 일차항체는 IgG 분자이며 항원과의 결합부위를 갖는 Fab (antigen binding fragment)라 불리는 짧은 사슬과 Fc(crystallizable fragment)라고 불리는 긴 사슬로 구성되어 있다.
일차항체(Primary Antibody)는 일반적으로 단 클론항체 (Monoclonal Antibody)와 다 클론항체(Polyclonal Antibody)로 구분된다. 항원의 분자량이 크면 항원 결정부위가 많아서 여러 종류의 항체를 생성할 수 있다. 이와 같이 한가지의 항원에 존재하는 다수의 항원 결정부위에 각각 결합할 수 있도록 여러 종류의 항체가 혼합된 항혈청을 다 클론항체라 한다.
실험 방법
1. 실험 과정
1) 검체의 준비
신선한 조직의 냉동 절편이나 고정액에 고정된 조직을 파라핀에 굳혀서 3-4micron으로 박절하여 silinated coating 된 slide 혹은 probe on plus slide에 붙여 놓는다. 냉동절편의 경우는 10% Formalin in PBS 에 10분간 고정하고 -20℃의 Methanol에서 3～5분 방치후 -20℃ 아세톤에서 1～3분 고정한 후 PBS로 수세하여 조직을 준비하거나, -70℃의 냉동고에 보관하거나 즉시 이용한다. 파라핀조직에 굳힌 경우는 실험 하루 전에 박절 후 약 56℃에서 40분간 부착 시킨 후 실온에서 보관하며 실험 시작 약 1시간 전에 56℃에서 20분간 부착시킨 후 사용한다. 파라핀 조직을 염색하는 방법은 다음에 나오는 '염색시약 및 과정'을 참조한다. 단, 냉동절편의 경우는 파라핀 제거와 알코올의 수세과정 이후의 과정부터 시행하면 된다.
2) 조직을 붙여 고정시킨 슬라이드를 준비한다.
3) PBS buffer로 슬라이드를 5분간 두 번 세척한다.
4) serum을 슬라이드 위에 도포한다(blocking 단계). - 5분
5) serum을 슬라이드를 기울려 흘려낸다.
6) 1차 항체(1:100으로 희석)를 슬라이드 위에 올리고 마르지 않게 주의한다. 마르면 전체적으로 갈색으로 변색될 수 있다. - 10분
7) PBS buffer로 2번 씻어낸다.
8) 2차 항체는 1:1000으로 희석하여 도포한다. - 15분
9) PBS buffer로 두 번 씻어낸다.
10) ABC dropping. Peroxidase Blocking - 5분 반응
11) DAB를 조금 떨어뜨린다.- 5분반응
12) 현미경 관찰한다.
[면역학실험]Immunohistochemistry 레포트
실험 목적 알고자하는 조직 내 특정물질을 항원-항체반응을 이용하여 특이적으로 검출한다. 실험 이론 및 원리 면역 조직 화학적 검사 항원과 항체간의 반응을 이용하여 세포나 조직 내에 존재하는 물질을 확인하는 면역염색법이다. 면역조직화학적 염색의 발전은 면역형광법의 개발로 활성화 되었다. 면역 형광법은 형광색소를 부착시킨 항체를 조직절편에 부착시키고 완충액으로 세척하면 항원과 선택적으로 결합한 항체만 남게 된다. 이러한 방법으로 염색한 조직절편을 형광현미경으
www.happycampus.com
댓글