antigen-antibody의 특이적인 인식과 결합에 기초하여 조직 또는 세포 내 특정 antigen의 존재유무 및 존재부위를 알아보기 위해 사용하는 방법이다.
면역조직화학법의 원리
면역조직화학적 검사를 이용하여 검출하는 항원은 분자량이 5,000정도인 단백, 다당류, 핵산 등의 고분자 물질이다. 항원에는 항체를 식별하는 특정한 부위가 있는데, 이를 항원 결정부위 (epitope) 라고 부르며 분자량 5,000에 대하여 한군데가 있는 것으로 알려져 있다. 즉, 분자량 이 20,000이면 4개 정도의 항원 결정부위가 있다.
항원에 결합하는 항체는 혈청내의 면역글로블린 (Immunoglobulin, Ig) 이라 부르는 단백질에 존재한다. 면역조직화학에 이용되는 일차항체는 IgG 분자이며 항원과의 결합부위를 갖는 Fab(antigen binding fragment)라 불리는 짧은사슬과 Fc (crystallizable fragment) 라고 불리는 긴 사슬로 구성되어 있다.
일차항체(Primary Antibody)는 일반적으로 단일클론항체 (Monoclonal Antibody) 와 다 클론항체 (Polyclonal Antibody) 로 구분된다.
표지물질로는 Horse-Radish Peroxidase, Glucose Oxidase, Alkaline Phosphatase 등의 효소와 Fluorescein Isothiocyanate (FITC: 황녹색 형광), Tetrame-thylrhodamine isothiocyanate (TRITC: 적등색 형광) 와 같은 형광색소가 이용된다.
효소를 표지물질로 이용하는 방법은 형광색소나 방사성 동위원소에 비하여 여러 가지 장점을 갖고 있다. 즉, 효소의 반응이 반복되므로 민감성이 높고 방사성 동위원소와 같이 사용상의 규제와 특별한 시설을 필요로 하지 않으며, 형광물질이나 중금속은 형광현미경과 전자현미경적 검색에만 사용할 수 있지만 효소는 광학현미경과 전자현미경 모두를 사용할 수 있다.
양성반응을 관찰하기 위한 발색 과정은 부착시킨 효소의 종류에 따라 선택할 수 있다. 발색제는 Horse-Rradish Peroxidase를 부착시킨 검출계(detection system)를 이용한 경우 Diamino- benzidine(DAB), 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC)를, Glucose Oxidase는 Tetrazoilum을 alkaline phosphatase는 BCIP/NBT, BCIP/INT, New fuchsin, Fast Red TR Salt 등을 사용 한다.
면역조직화학법의 종류
면역조직화학적 검사방법은 직접법 (Direct Method) 과 간접법 (Indirect Method)으로 크게 구분할 수 있으며, 간접법은 표지물질을 결합시킨 항체를 사용하는 표지 항체법 (Lable Conjugate Antibody Method)과 비표지 항체법 (Unlabelled Antibody Method)으로 구분된다.
간접법 가운데 가장 간단한 표지항체법은 일차항체에는 효소를 부착하지 않고 일차항체의 Fc부분에 특성을 갖는 이차항체에 효소를 부착하여 사용하는 방법이다. 이때 일차항체를 제조하는 동물과 이차항체를 제조하는 동물은 달라야 한다. 비표지항체법은 일차 혹은 이차항체에 표지물질을 부착시키지 않는 방법으로서 민감성이 매우 높은 방법이다. 여기에 해당되는 검사방법은 PAP법, ABC법 그리고, Protein A 법 등이 있다.
일반적으로 직접법은 비교적 간편하고 여러 단계를 거치는 간접법에 비해 비 특이적인 염색소견이나 Background Staining이 적다. 그러나 각각의 항체마다 효소를 부착해야 되는 어려움이 있다.
이에 비하여 간접법은 각각의 항원에 대한 일차항체를 제조한 동물이 동일한 경우에는 이차항체를 공통적으로 사용할 수 있고, 여러 과정을 거침으로서 반응의 강도를 증가시킬 수 있다. 간접법은 시간이 많이 소요되고 검사과정이 복잡하며, 비특이적 반응이나 배경이 염색되는 단점이 있었으나 최근 들어 자동 및 반자동 염색기의 개발과 시약의 개발 등으로 시간이 단축되었고 비 특이적인 염색이 줄어들었다.
면역조직화학에서의 항체의 검출
조직에 부착된 항체들을 검출하기 위해서 표지물질로 효소나 형광색소를 사용할 수 있다.
Table 1에 일반적으로 흔히 사용되는 효소와 발색제들을 열거해 놓았고, Table 2에는 일반적으로 흔히 사용되는 fluorochrome을 열거해 놓았다.
|
Enzyme |
Chromogen |
Abbreviation |
Appearance |
|
Horseradish Peroxidase (고추냉이과산화효소; HRP) |
3-3' Diaminobenzidine |
DAB |
Brown |
|
Diaminobenzidine with nickel enhancement |
DAB/Nickel |
Gray/Black |
|
|
4-Chloro1-naphthol |
N/A |
Blue |
|
|
3-Amino 9-ethylcarbazole |
AEC |
Red |
|
|
Alkaline Phosphatase (송아지 장내 알칼라인 인산분해효소; AP) |
Naphthol-AS-BI-phosphate/ fast red TR |
NABP/FR |
Red |
|
Naphthol-AS-MX-phosphate / fast red TR |
NAMP/FR |
Red |
|
|
Naphthol-AS-BI-phosphate / New Fuchsin |
NABP/NF |
Red |
|
|
Bromochloroindolyl phosphate / nitrobluetetrazolium |
BCIP/NBT |
Purple |
|
|
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-d-galactopyranoside |
BCIG |
Blue |
Table 1. Commonly used enzymes and chromogens
|
Fluorochrome |
Excitation (nm) |
Emission (nm) |
Appearance |
|
AMCA |
350 |
450 |
Blue |
|
Cy3 |
550 |
680 |
Orange, red |
|
Cy5 |
650 |
680 |
Orange, red |
|
Fluorescein (FITC/DTAF) |
495 |
520 |
Grenn |
|
Hoechst 33258 |
360 |
470 |
Blue |
|
B-phycoerythrin |
545, 565 |
575 |
Orange, red |
|
R-phycoerythrin |
480, 545, 565 |
578 |
Orange, red |
|
Rhodamin |
539, 574 |
602 |
Red |
|
Texas red |
558, 594 |
623 |
Red |
Table 2. Commonly used fluorochromes
면역조직화학법의 응용
① HRP (HorseRadish-Peroxidase) Conjugation Technique
1966년에 Graham과 Karnovsky에 의해 개발된 것으로, HRP이라는 효소를 사용하여 ultrastructural level에서 조직화학을 표명하는 방법이다. 항원에 항체, coupling agent, HRP를 차례로 결합시켜 복합체를 만든다. 이 때 사용되는 coupling agent로는 p,p'-difluoro-m,m'-dinitrophenyl sulphon (FNPS), glutaraldehyde, sodiumperiodate가 있다.
② PAP (Peroxidase-AntiPeroxidase) Method
과산화효소 (peroxidase) 에 대한 항체를 만들고, 이 항체와 과산화효소를 면역학적으로 결합시켜 형성된 면역 복합체인 PAP를 사용하는 방법이다. 이 방법은 먼저 표본내의 항원을 일차항체 및 이차 항체와 반응시킨 후에 일차항원과 같은 동물에서 만든 PAP를 이차항체와 결합시켜 양성 반응을 관찰하는 것이다.
PAP법은 하나의 항원-항체 반응물에 3개의 과산화효소가 결합되어 있어서 면역반응물을 확인하는데 민감성이 증가된다. 일반적으로, hydrogen peroxide (H2O2) 가 존재할 때, peroxidase가 chromogen인 DAB (3-3' diaminobenzidine) 을 산화시켜 검은 갈색을 나타냄으로써 최종산물이 visualization된다.
③ ABC (Avidin-Biotin Complex) Method
1981년도에 처음 소개되었으며, 당 단백인 Avidin이 저 분자량 비타민인 Biotin에 친화력이 매우 강한 점을 이용한 방법이다.
Avidin은 계란 흰자위에 존재하는 당단백으로서 4개의 Biotin과 결합할 수 있는 입체구조를 갖고 있다. Biotin (Vitamin-H) 은 쉽게 항체의 Fc부분에 부착되므로 이차항체에 부착시켜서 사용하고 있다.
ABC 방법의 처리과정은 수정된 PAP 방법으로 PAP 방법보다 더 민감하다. 일차항체를 조직면에 존재하는 항원에 결합시키는 단계까지는 PAP 방법과 동일하나, 이차항원을 첨가하는 과정에서 Biotin이 부착된 이차항체 (biotinylated antibody or biotin-labelled secondary antibody) 를 반응시킨다는 점이 PAP 방법과 다르다.
Avidin과 효소가 부착된 검출계 (avidin/biotinylated enzyme or PAP-streptavidin complex) 가 이차항체에 부착된 Biotin과 결합하는데, 그 결합력이 강하여 PAP 방법보다 더 민감한 것이다. 또한 이 방법은 하나의 항원에 여러 개의 효소가 부착될 수 있으므로 민감도가 매우 높은 방법이며 현재 가장 많이 이용하고 있는 방법이기도 하다. 이 방법에 사용되는 Avidin에는 탄수화물이 존재하여 Lectin과 같은 물질에 친화력을 나타내므로 비특이적인 결합을 할 수 있다.
일반적으로, PAP 방법과 마찬가지로 hydrogen peroxide (H2O2) 가 존재할 때, peroxidase가 chromogen인 DAB (3-3' diaminobenzidine) 을 산화시켜 검은 갈색을 나타냄으로써 최종산물이 visualization된다.
④ LBC (Labeled (Strep)Avidin-Biotin) Method
1987년에 미국의 Zymed사에 의하여 처음으로 상업화된 염색 KIT로, 기존 ABC 방법보다 더욱 민감하고, 빠르고, 깨끗한 효과를 얻을 수 있고 검사 단계를 줄일 수 있어 현재 가장 많이 상용화하고 있다.
LAB법은 affinity purified된 이차항체를 사용하며 streptavidin에 biotinylated된 enzyme을 사용하지 않고 streptavidin에 enzyme을 직접 부착시켜서 사용하고 있다.
Streptavidin이란 Streptomyces Avidinii라는 세균의 배양액으로부터 추출되는 Avidin과 유사한 특성을 갖고 있으면서 탄수화물을 포함하고 있지 않기 때문에 Avidin의 결점을 보완할 수 있다. 최근에는 검출계에 avidin 대신하여 streptavidin을 부착시켜 염색에 이용하고 있다.
⑤ NBA (Non-Biotin Amplification) Method
NBA 검출방법은 1999년 미국의 Zymed사에서 개발된 새로운 염색법으로, biotin, avidin 혹은 streptavidin의 부착없이 일차항체의 chromogenic visualization (발색구현)을 실현시킨 획기적인 방법이다. 조직과 세포내에 내재된 Biotin 검출을 원천적으로 차단시켜 고질적인 배경염색을 없앨 수 있는 유일한 방법으로 차세대 염색을 주도할 상품으로 여겨진다. FITC-Conjugated된 이차항체에 HRP가 혼합된 Anti-FITC와 결합시켜 기존의 ABC 법과 LAB 법의 Biotin과 Enzyme을 배제 시켰다. HIER Methods를(Heat Induced Epitope Retrieval) 사용하는 항원 검사에 특히 좋다.
댓글