미생물의 분리, 배양에는 미생물의 종류 및 사용 목적에 맞는 배지가 필요하다. 미생물은 종류에 따라 필요한 영양분이 다르며, 배지에 따라 대상으로 하는 미생물의 생육에 필요한 영양소를 적당량 가지고 있어야 한다. 또한 pH와 물리성이 맞아야 하고 무균적 이어야 한다.
미생물
매우 작아서 육안으로는 관찰할 수없는 생물에 대한 편의적인 총칭. 단세포생물은 물론 다세포성일지라도 구성세포간의 형태, 기능분화가 거의 없는 생물도 포함시킨다. 즉, 모든 원핵생물(세균, 남색세균, 고세균)과 진핵생물의 일부(사상균, 효모, 변형균, 담자균, 단세포성의 조류및 원생동물)가 미생물이 되고 때로는 다세포성의 대형 조류까지도 포함시킨다. 바이러스도 미생물로 취급되는 경우가 있다.
일반적으로 미생물을 취급하는 경우에는 목적으로 하는 미생물의 순수분리, 무균조작, 배양 등의 수단이 공통으로 필요하다. 미생물 중에는 의학적, 농학적으로 사람의 생활과 깊은 관계를 갖는 것이 많이 있다. 또한 생장이 빠르고 대사활성이 높으며 정량적인 조작을 하기 쉽다는 등의 점에서 생물학(예를들면 분자유전학 등)의 분야에서도 실험재료로서 널리 이용되고 있다. 병원미생물, 발효미생물, 토양미생물, 해양미생물 등으로 구별하기도 한다.
배지
균이나 세포 배양에 사용하는 용액(액체배양) 또는 한천 등으로 고정시키는 고형 배지. 생물의 생존이나 증식을 유지하기 위해 염류, 탄소원, 질소원 등이 포함되어 있기도 한다. 또 세포에 적합한 삼투압과pH를 유지하기 위해 완충액을 포함하기도 한다. 이는 생물이 독립영양계인가 또는 종속영양계인가에 따라 달라진다. 예를 들면 독립영양계의 식물세포는 염류와 무기질소원이 있어야 한다. 그러나 종속영양계의 포유류세포의 배지는 염류와 더불어 글루코오스, 비타민, 아미노산 등의 유기물질을 필요로 한다. 완충액계는 인산염-탄산수소염과 이산화탄소로 구성된다.
1. 물리적 성상에 따른 분류
1) 액체배지(Liquid media)
각 성분을 증류수에 녹인 액상의 배지로 broth 또는 bullion이라 하며 미생물의 증식, 생화학적 검사 및 대사산물 검출 목적 등에 사용됩니다.
2) 고체배지(Solid media)
액체배지에 한천(agar), 혈청(serum), 젤라틴(gelatin) 등의 고형화 물질을 첨가하여 고형화한 배지로 상온에서 고체입니다. 한천은 녹는점과 굳는점의 온도차가 커서(녹는점 : 90~100℃, 굳는점 : 40~50℃) 고체배지를 만드는데 적합합니다. 뿐만 아니라, 한천은 고분자 다당류여서 한천을 분해하는 박테리아는 거의 없습니다. 형태에 따라 평판배지, 고층배지, 사면배지 및 반사면배지 등이 있습니다.
① 평판배지(plate media) : petri dish에 고체배지를 약 4mm 두께 정도로 굳힌 것 미생물의 분리배양, 집락의 관찰 용혈능 및 항생제 감수성 검사 등에 사용
② 고층배지(butt media) : 시험관에 고체배지를 세운 상태로 굳힌 것 혐기성균의 배양 및 운동성 시험 등에 사용
③ 사면배지(slant media) : 시험관에 고체배지를 약 45˚ 경사가 되도록 굳힌 것 호기성 미생물의 증식 및 보존, 콜로니 관찰 등에 사용
④ 반사면배지(semislant media) : 고층배지의 위 1/3 정도만을 사면으로 굳힌 것 세균의 생화학적 검사 등에 사용
2. 배지 성분에 따른 분류
1) 천연배지(Natural media)
천연배지는 필요한 탄소원이나 질소원 등의 영양물질을 육즙(meat extract), 효모추출액(yeast extract), 감자, 토마토, 우유, 펩톤 등 자연산물로 만든 배지로, 충분한 영양분은 함유하고 있으나 각 성분의 양 및 종류 등을 정확하게 표시할 수 없는 것으로 미생물의 증식 및 분리 배양에 쓰입니다.
2) 합성배지(Synthetic media)
합성배지는 여러 가지 화학적 성상이 분명한 영양분을 넣어 만든 배지로서 넣어준 영양분의 성분 및 농도를 규명할 수 있으므로, 화학적 규명배지(chemical defined medium)라고도 합니다. 미생물의 생화학적 성상, 균체성분, 미생물의 대사 및 유전 연구 등에 쓰이며 최소 영양배지라고도 합니다.
3. 사용 목적에 따른 분류
1) 선택배지(Selective media)
두 종 이상의 세균이 혼합되어 있는 경우 원하는 균만을 선택적으로 분리 배양하는데 사용하는 배지로 색소나 중금속, 화학약품, 항균제 등의 원하지 않는 균의 증식을 억제하는 물질을 함유하고 있습니다. 또한 배지 내의 기질 분해에 따른 pH 변화를 나타내는 지시약이 포함된 것도 있습니다.
① 장내 세균 선택배지 : MacConkey agar, EMB agar, Endo agar, SS agar
② 포도상구균 선택배지 : Potassium tellurite blood agar, Mannitol salt agar
2) 증식배지(Growth media)
여러 미생물이 혼합하여 존재할 때 모두 증식시키기 위해 필요한 영양을 충분히 넣어 만든 보통의 증식배지와 한 종류의 미생물이 잘 자랄 수 있도록 그 미생물에 적합한 영양원을 넣어주어 필요한 미생물을 증식시키는 특수증식 배지가 있습니다. 보통 병원성 박테리아를 분리하는데 많이 쓰이며 일반 배지에 혈액을 넣어 혈액 영양배지를 만들어 사용합니다.
① 세균 : nutrient agar (broth), peptone agar (broth)
② 곰팡이 및 효모 : malt extract agar (broth), potato dextrose agar (broth)
3) 감별배지(Defferential media)
같은 평판에 자라고 있는 미생물 중에서 특정 콜로니를 다른 콜로니와 구별하는데 이용하는 배지입니다. 예를 들면 EMB (eosin methylene blue) 영양배지에서 젖당을 발효하여 산을 생성하는 균은 금속성의 광택이 나는 녹색의 콜로니를 형성합니다. 그러므로 젖당을 만들지 못하는 박테리아와 쉽게 구별할 수 있습니다.
① Mannitol salt agar
② Bismuth sulfate agar
③ Triple sugar iron agar, Urea agar
4) 강화배지(Enrichment media)
많은 세균이 혼합된 경우 특정의 균종만을 다른 균종보다 빨리 증식시켜 분리 배양이 쉽게 되도록 한 배지입니다.
① Dubros broth
② Bordet-Gengou agar
③ Gram-negative broth
5) 수송배지(Transport media) 또는 보존배지(Preservative media)
분리 배양하기 전까지 검사 재료를 수송할 때 사용하는 배지로 재료 중의 세균이 너무 증식하거나 사멸되지 않도록 고안된 배지입니다.
① Buffered glycerol saline
② Cary and Blair transport media
③ Amie's transport media
④ Stuat's transport media
영양 배지
수육 또는 어육의 추출액을 일반적으로 사용하는 세균배지의 일종으로 주로 부생유기영양의 세균배양에 사용한다. 보통 시판되는 스프용 또는 특히 세균학용 추출액 0.3%에 펩톤 0.5%, 경우에 따라서는 0.5% 효모침출물,0.8% 식염 등을 첨가하여 pH 7 정도로 조정한 것을 기본배지로 사용한다. 여기에 한천 1.5%를 첨가하여 고형배지로 만드는 경우가 많은데, 이를 한천배지라고 한다. L. Pasteur를 비롯하여 많은 연구자들이 널리 사용하였으며 이 배지에서 발육하는 세균의 종류는 대단히 많지만, 실제로는 역사적으로도 육즙기술이 세균에 대한 인식을 제약하고 있는 것은 일단 고려해야한다
미생물 필요 영양소
1. 대량원소 대량영양소 : 탄소, 산소, 수소, 질소, 황, 인, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등
2. 미량원소 미량영양소 : 철, 망간, 아연, 코발트, 몰리브덴, 니켈, 구리 등
3. 생장 인자
1) 필수 성분이지만 미생물이 스스로 합성하지 못하는 물질
2) 아미노산, 퓨린, 피리미딘, 비타민등
|
원소 |
주요기능 |
|
탄소 산소 수소 질소 황 인 |
탄수화물, 지질, 단백질, 핵산 구성성분 |
|
칼륨 |
효소활성에 필요 |
|
칼슘 |
세균 내생포자의 내열성 증가 |
|
마그네슘 |
조효소 ATP 복합체 |
|
철 |
전자전달, 헴단백질, 인, 시토크롬 일부 조효소 |
|
몰리브덴 |
질소 고정 |
|
코발트 |
비타민 B12 구성요소 |
배지에 사용되는 주요 성분
1. 펩톤(peptone)
탄소원 및 질소원으로 가장 많이 사용되며 거의 모든 배지에 함유되어 있습니다. 아미노산, 펩타이드가 주성분이며, 그 외에 당류(대두 제품이나 우유 제품), 소량의 비타민을 함유한 것도 있습니다. 동물의 근육, 간, 혈액이나 카제인(casein), 젤라틴, 대두 등의 단백질을 펩신(pepsin) 또는 트립신(trypsin), 판크레아틴(pancreatin) 등 단백질 가수분해 효소로 분해하여 건조 분말로 만든 것으로 원료 및 제법에 따라 약간의 조성의 차이가 납니다. 보통 시판되는 펩톤은 근육으로 만든 제품으로 많은 균을 배양하는데 적합하며, 카제인 효소 분해물인 트립티케이스(trypticase), 카지톤(casitone), 트립톤(tryptone), 등은 트립토판(tryptophan)을 많이 함유하고 있습니다.
2. 육즙 성분(Beef extract, Meat extract)
소 또는 말의 근육 부분의 수용성 추출물을 농축, 건조하여 분말 상태로 만든 것으로 아미노산 펩타이드 외에 유기산류, 인산, 비타민류 등을 함유하고 있어 많은 균의 발육에 적당합니다. 원료로 근육 부분 이외의 장기 즉 심장, 뇌, 간 등의 추출물을 사용하는 경우도 있으며, 이를 각각 heart infusion, brain infusion, liver infusion이라 합니다. 이들은 단순한 육즙 성분보다 비타민 등 발육인자를 더 많이 함유하고 있으므로 보통 배지에서 잘 배양되지 않은 균의 증식에 이용됩니다.
3. 효모 추출물(Yeast extract)
효모를 자기융해 등의 방법으로 파괴하여 상층액을 농축 건조시킨 것으로 아미노산, 펩타이드, 당류(glycogen, trehalos) 및 퓨린(purin) 등 핵산류, 비타민 등을 다량 함유하여 균 발육에 좋습니다
4. 맥아 추출물(Malt extract) 및 감자즙(Potato extract)
맥아 추출물은 맥아를 당화, 여과시킨 것으로 말토오스(maltose) 등의 당을 많이 함유하고 있어 곰팡이 및 효모의 배양에 적합하며, 감자즙은 감자의 수용성 추출물에 글루코오스(glucose)를 첨가한 것으로 곰팡이 효모 배양에 좋습니다.
5. 혈액 및 혈청(Blood and serum)
혈액은 단백질 이외에도 여러 가지 많은 영양 성분을 함유하고 있는 중요한 배지 재료의 하나입니다. 특히 Haemophilus속의 균은 증식시 heme 성분이 발육인자로 요구되므로 배양할 때 혈액을 가해야 합니다.혈청은 렙토스피라 및 결핵균 배양 배지에 사용됩니다. 가열하여 응고시킨 것은 디프테리아균 배양에 적합합니다.
6. 한천(Agar)
해초에서 얻는 다당체(agarose, agaropectine)로 고도의 겔(gel)화 능력을 갖고 있습니다. 식용 한천도 배지에 사용할 수 있지만 불순물이 많으므로 배지로 사용할 때는 정제 한천을 사용합니다. 냉수에는 녹지 않고 가열(90~95℃)하면 녹지만, 용해 후 40~45℃가 될 때까지 겔화되지 않습니다. 일단 한 번 용해된 한천은 대략 55℃까지 액체 상태를 유지하므로, 열에 약한 물질을 첨가한다든지 생균을 직접 부유시켜 고형화시킬 수 있습니다. 또한 정제 한천은 영양분을 함유하지 않을 뿐만 아니라 균에 의해서 가수분해 되지 않기 때문에 배지의 고형화제로 매우 적합합니다. 배지 중의 한천 농도는 1.5%가 일반적이지만 약간 낮은 것도 있습니다.
7. 겔라틴(Gelatin)
동물의 뼈, 피부, 인대 등을 물로 가열 추출하여 건조시킨 황갈색의 입자 또는 분말로 일명 아교라고도 합니다. 세균학 발달 초기에는 고체배지에 이용되었으나, 용해 온도가 37℃이상이고 젤라틴을 소화시키는 균 등이 있으므로 지금은 고형화제로 사용하지 않고 단백질 분해시험의 하나로 겔라틴 액화시험 등에만 이용됩니다.
8. 계란 및 난알부민(Egg and egg albumin)
흰자는 다른 성분과 혼합한 후 혈액 응고기로 응고시켜 결핵균 배지 등에 사용되며, 노른자는 레시티나제 검출을 위한 lecitovitellin 배지의 주요 성분으로 쓰입니다.
9. 담즙 및 담즙산염(Bile and bile salt)
신선한 담즙 및 담즙 분말 또는 담즙산염을 배지에 첨가하여 균의 증식을 억제하거나 촉진하는 증균 배지나 감별 배지 조제에 쓰입니다.
10. 색소 및 지시약
색소는 잡균의 발육을 억제하기 위하여 첨가되거나 배지의 pH 변화나 산화 환원 전위의 변화를 알기 위하여 지시약으로 넣습니다. pH 지시약으로 phenol red, 산화환원 전위 지시약으로 메틸렌 블루, resazurin 등이 이용됩니다.
한천 배지 제조법
배지는 대상 미생물에 따라 적합한 조성비가 다르다. 대표적으로 사용되는 한천 배지의 일반적인 제조과정은 다음과 같다.
1) 증류수에 영양소와 agar를 잘 섞으며 끓여 녹인 후 멸균기에 돌린다.
2) 45~50℃ 정도로 식힌뒤 plate에 붓는다.
3) 바로 사용하는 것이 좋으나 보관할것이라면 냉장고에 넣어둔다
댓글