천연물화학 | 천연물 성분의 분리 정제

TIP

 

 

1. 유기 용매를 이용한 추출
2. 크로마토그래피를 이용한 분리 정제
3. 천연물 성분의 화학구조 결정
4. 핵자기 공명분광법
5. 자외선 및 가시광선 분석법
6. 적외선 분광분석법
7. 질량 분석법
8. X선 분광분석법

 

 

 

1. 유기 용매를 이용한 추출

천연물 연구의 대상으로 채집된 2차 대사들의 일부를 동결 건조한 후 잘게 자르고 유기 용매로 추출한다. 이때 사용하는 유기용매는 실험실에 따라 다르지만 극성인 용매와 비극성인 용매를 순차적으로 또는 반복해서 사용한다. 비극성인 용매로는 디클로로메탄(MC), 에틸아세테이트(EtoAc) 등이 쓰이고, 극성인 용매로는 메탄올, 에탄올, 아세톤 등이 사용된다. 거름종이로 거른 추출 혼합용액을 감압하에서 증발하여 농축 하고 생리활성의 유무를 측정한다.

 

분리하고자 하는 활성물질이 산성 또는 염기성의 지용성 물질인 경우, 유기용매 추출시 물층의 pH를 조정함으로써 효과적으로 분리 할 수 있다. 염기성 물질인 경우 물층의 pH를 2～5로 조정하여 유기용매로 추출하여 제거하고, 남은 산성 수용액을 pH 9～10으로 하여 유기용매로 추출하면 활성물질을 유기용매 층 에서 얻을 수 있다. 또한 산성물질인 경우 이 와 반대로 행하여 유기용매 층에서 활성물질을 얻을 수 있다. 이때는 반드시 활성물질의 pH 에 대한 안정성이 확인되어야 한다.

 

생리활성의 결과에 따라 추가적인 화학분석 진행 여부가 결정되면 수 ㎏에 해당하는 천연물을 대상으로 본격적인 분리 정제에 들어간다. 동일한 방법으로 다량의 추출물이 모아 지면 추출물에 포함된 천연물의 극성에 따라 분리를 시작한다. 많은 경우 천연물을 물과 디클로로메탄을 써서 분배를 한 다음, 물층을 다시 n-부탄올로 추출하는 방식으로 분배 한다. 이 경우 비극성인 화합물은 디클로로메탄 층으로, 중간 정도의 극성인 화합물은 n-부탄올 층으로, 각종 염과 아미노산 등 물에 잘 녹는 대사물질은 물 층으로 분배된다.

 

때에 따라 디클로로메탄 층의 비극성화합물을 n-헥산과 물-메탄올의 혼합용액(15:85)으로 분배하여 지질화합물을 n-헥산 층으로 뽑아내기도 한다. 이러한 연속적인 분배는 추출물에 포함된 천연물을 극성에 따라 분류함으로써, 다음 단계의 여러 가지 분리방법의 효과를 증가 시킨다. 이어 각 분액에 대하여 생리활성을 다시 측정하여 어느 분액으로 원하는 화합물이 농축되었는지를 판단하고, 특정 분액에 대하여 추가적인 분리를 시도한다. 용액의 극성에 따른 분배가 잘 진행 되었을 경우 생리활성 천연물의 농도가 특정 분액으로 농축되므로 생리활성은 조추출물에 비해 훨씬 강하게 나타난다.

 

 

2. 크로마토그래피를 이용한 분리 정제

생리활성이 있는 분액에 대하여 크로마토그래피를 이용하여 분리를 진행한다. 크로마토그래피는 종류와 기능에 따라 여러 가지가 있지만 일반적으로 고정상과 이동상의 극성에 따른 평형을 이용하는 실리카겔 크로마토그래피와 역상크로마토그래피가 주로 많이 사용된다. 이 외에도 겔 여과크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 분취 실리카겔 박층 (preparative thin layer) 크로마토그래피 등 이 천연물 분리에 자주 사용된다.

 

실리카겔 크로마토그래피(Silica gel Chromatography)는 일반적으로 시료양의 약 20～30배에 해당하는 실리카겔 (silica gel)을 컬럼(column)에 채우고 시료를 가하여 실리카겔에 시료를 흡착시킨 다음, 비 극성용매와 극성용매의 농도를 변화시키며 흘 려주는 방식으로 진행된다. 가장 자주 사용되는 용매계로는 클로로포름과 메탄올 혼합, n-헥산과 아세트산에틸 혼합 등이 있으며, 기본 적으로는 박층 크로마토그래피(TLC)로써 각 종의 전개용매를 검토하여 분리능이 양호한 전개용매를 결정한다. 클로로포름을 전개용매로 사용하는 경우 다른 용매에 비해 비중이 커 서 유출속도가 빨라지는 경향이 있으므로 주의하여야 한다. 마지막에는 극성용매인 메탄올로서 실리카겔에 흡착되어 있는 물질을 완전히 용출한다.

 

효과적인 실리카겔 크로마토그래피를 수행하는 경우 실리카겔의 양, 전개 용매, 유속이 중요하다. 얻어진 분획은 어느 분획에 생리활성이 있는가를 확인한 후 활성 분획을 모아 농축하여 냉동고에 보관한다. TLC 및 HPLC로써 순도를 확인하고 필요하다면 다시 컬럼 크로마토그래피 또는 HPLC 로 정제하여 순수물질을 얻는다. 실리카겔은 반응성이 강하고 극성이 커서 여러 가지 극성 관능기를 가진 천연물이 쉽게 결합하는 단점이 있다. 이 경우 실리카겔의 극성표면을 화학적으로 처리하여 C18, C8, 알킬기, 방향족인 페닐기, 시안기 등의 관능기를 결합시켜 그것을 고정상으로 이용하는 역상 크로마토그래피를 이용한다.

 

실리카겔에 비극성의 관능기가 결합되면 입자의 표면은 비극성으로 바뀌게 되고, 이에 따라 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)에 의해서 물질은 고정상과 이동상 사이에서 분리된다. 이 경우 이동상으로는 실리카겔 크로마토그래피와 달리 메탄올, 물 등의 극성용매가 이용된 다. 일반적으로 실리카겔 크로마토그래피와 같이 고정상이 이동상보다 극성이 큰 경우를 순상 크로마토그래피라고 하는데 반해 이동상 이 고정상 보다 극성이 큰 경우를 역상 크로마토그래피라고 한다. 역상 크로마토그래피에서 는 시료 중 극성이 작은 성분일수록 극성이 큰 시료 성분보다 늦게 용출되며 물, 메탄올, 아세토니트릴, 테트라히드로 퓨란(THF), 완충용액 등과 이들의 혼합 용액이 이동상으로 사용된다.

 

겔 여과 크로마토그래피는 고정상에 해당하는 다공성의 고분자 흡착제(resin)의 성질을 이용하여 분자의 크기에 따라 분리하는 방법이다. 가장 흔히 사용되는 겔 여과 크로마토그래피는 세파덱스(Sephadex) LH-20로서 극성이 큰 알코올성 물질의 분리에 효과가 크다. 용매는 주로 메탄올을 쓰며 때에 따라 물, 클로로포름, 아세톤 등을 섞어 쓰기도 한다. 세파덱스는 분자체 작용에 의해 혼합물 시료 중의 각 시료성분을 분자 크기별로 분리 용출시키는 방법으로 약간의 흡착분배의 가능성도 있으나 실리카겔과 같은 물질의 흡착, 변화의 가능성은 적다. 일반적으로 분리능을 증가시키기 위해 가늘고 긴 컬럼을 사용하고 실리카겔 컬럼 보다는 느린 유속으로 용출시킨다.

 

이온 교환 크로마토그래피는 추출물의 활성 성분이 수용성물질로 판단될 경우 분리하고자 하는 물질의 성질(염기성, 산성, 양쪽성, 중성) 을 조사한 후 사용한다. 이 크로마토그래피는 담체에 결합되어 있는 이온의 성질에 따라 양 이온 교환과 음 이온 교환으로 분류되는데 양 이온 교환 수지에 적용되는 작용기는 황산염, 초산염이고, 음이온 교환수지에는 암모늄염이 주로 이용된다. 다우엑스(Dowex)나 앰버라이트 (Amberlite)와 같이 자주 이용되는 이온교환 수지로 어느 정도 정제가 진행된 단계에서는 세파덱스 계의 이온 교환체를 사용할 수 있다. 분취 실리카겔 박층 크로마토그래피는 지용성 물질에 대해서 많이 이용되는 정제수단이다.

 

박층 크로마토그래피(TLC)는 활성물질을 관 크로마토그래피를 행하여 분리할 때 용출 용매의 선택 등에 중요하게 이용된다. 또한 Rf 값의 재현성과 분해능이 좋으며, 분석 소요시간이 짧고, 용매, 발색시약에 제한이 없으므로 여러 종류의 물질 분석에 이용할 수 있다. 일반적으로 실리카겔 TLC의 두께가 0.25㎜인 것은 분석용으로 0.5㎜나 1.0㎜는 분취용으로 사용되고 있다. TLC상에 나타난 화합물 가운데 원하는 특정 성분을 분리하려면 적절한 용매계를 찾는 것이 중요하다. 자주 쓰이는 실리카겔 TLC의 용매계는 n-헥산-아세트산에틸 혼합, 클로로포름-메탄올 혼합, 클로로포름-메탄올 - 물 혼합 등이 있다. 분취 실리카겔 박층 크로마토그래피로 분리한 시료는 순도가 높으나 실리카겔에 흡착, 용출 과정 중에 분해하는 경우가 자주 있기 때문에 TLC 또는 HPLC로써 순도를 확인할 필요가 있다. 또한 TLC 판에 포함된 불순물이 들어 있거나 용매 추출시 이들 불순물이 용해되는 경우가 있기 때문에 추출 후에는 HPLC 등을 이용하여 다시 정제하는 것이 좋다.

 

실리카겔 TLC 외에도 역상 TLC와 HPTLC(High Performance Thin Layer Chromatography)가 천연물 분리 정제에 자주 이용된다. 실리카겔 TLC는 표면이 극성을 띠고 있어 극성물질과 강하게 결합하기 때문 에 분리능도 양호하지 못하고 흡착에 의한 물질의 손실이 크므로 아주 강한 극성을 가지는 화합물의 분리에는 적합하지 않다. 이런 경우 역상 TLC가 효과적으로 적용될 수 있다.

 

그리고 HPTLC는 담체 입자크기가 5~10 μm 로 일반 TLC 보다 작고 입도의 분포가 균일 하기 때문에 분리가 양호하고, 표면이 균질하여 재현성이 높다. TLC를 이용하여 화합물의 분리 정도를 판단하기 위하여 발색시약을 사용할 경우 분리하고자 하는 물질의 성질을 아는 것은 중요하다. 수용성 물질인 아미노산의 발색은 닌히드린(ninhydrin) 시약을 주로 이용하고, 알칼로이드 화합물의 발색은 드레겐도르프(Dragendorff) 시약을 사용하는 것이 효과적이다. 그 이외에 일반적으로 사용되는 범용 발색 시약은 10% 황산용액이나, 안이스알데히드(anisaldehyde)-황산 혼합용액이 널리 쓰인다.

 

 

 

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