일반생물학실험 | Harvesting chemical energy - Cellular respiration and fermentation

 

 

 

TIP

 

 

유기화학물질을 에너지원으로 이용하여 살아가는 생물들의 세 가지 에너지대사 방법 중 산소성호흡과 발효현상을 직접 관찰함으로서 생물의 에너지대사 현상에 대한 이해의 폭을 넓히기 위한 것이다.

 

 

 

지구에서 살고 있는 모든 생물들은 그들이 소유하고 있는 다양한 에너지 대사방법을 이용하여 여러 가지 종류의 에너지원(energy source)으로부터 생명활동에 필요한 에너지를 생산하고 있다. 생물들이 사용하고 있는 에너지원(energy source)에는 태양 광선과 화학물질(생물이 에너지원으로 이용할 수 있는 화학물질에는 유기물과 무기물이 있지만 이 곳에서는 유기물만 언급함)이 있는데, 그 중에서도 모든 생물들이 이용하고 있는 에너지의 근본적인 원천은 태양 광선이다.

 

즉, 녹색식물과 이끼류(algae), 광합성세균 등이 먼저 빛의 에너지를 ATP와 NADPH + H⁺ 등의 고에너지 화합물을 만드는데 사용하고, 이 고에너지 화합물들이 가지고 있는 에너지를 이용하여 무기물인 이산화탄소를 유기물인 탄수화물, 단백질, 지방 등으로 합성한다. 이와 같은 과정에서 빛의 에너지가 유기물이 소유한 에너지로 전환되는데, 태양 광선을 에너지원으로 이용할 수 없는 대부분의 생물들은 유기물을 에너지원으로 이용하고 있다.

 

유기물을 에너지원으로 이용하여 살아가는 생물들은 산소성호흡(aerobic respiration)과 무산소성호흡(anaerobic respiration) 및 발효(fermentation) 등 세 가지 서로 다른 에너지 대사방법을 이용하여 생명활동에 필요한 에너지를 합성하고 있다. 산소성호흡은 유기물로부터 에너지를 만드는 과정에서 산소가 전자전달계의 최종전자수용체 역할을 하는 호흡이고, 무산소성호흡은 세포 외부에서 들어온 무기물(이산화탄소, 황산염이온, 유황, 질산염이온 등) 또는 유기물(퓨마르산)이 전자전달계의 최종전자수용체 역할을 하는 호흡으로, 이 두 가지 과정을 통해 ATP가 만들어지는 방법을 산화적 인산화(oxidative phosphorylation)라 한다.

 

발효는 전자전달계의 최종전자수용체 역할을 하는 외부 물질의 도움없이 에너지원으로 사용되는 유기물질 자체가 효소에 의해 산화 또는 환원되면서 에너지를 방출하는 것으로, 이와 같은 과정을 통해 ATP가 만들어지는 방법을 기질수준의 인산화(substrate-level phosphorylation)라 한다. 진핵세포생물은 무산소성호흡을 하지 않으며, 산소성호흡은 미토콘드리아에서 이루어지고 발효는 세포질에서 일어난다. 그리고 세포내 소기관(cell organelle)이 없는 원핵세포생물의 경우에는 산소성호흡, 무산소성호흡, 그리고 발효가 모두 세포질에서 진행된다.

728x90

 

 

실험 방법

1. 산소성호흡 (I) (미토콘드리아를 이용한 실험)

1) 미토콘드리아의 분획 준비 (2-4℃에서 수행한다)

① 해부용 칼 또는 면도칼을 이용하여 신선한 쥐의 간에 붙어 있는 결합조직을 잘라낸 후 잘게 토막을 낸다.

② 토막 낸 간 조직(10 g)을 0.25 M sucrose 용액(20 ㎖)에 넣은 후, homogenizer를 이용하여 잘게 부순다.

③ 잘게 부셔진 간 조직 현탁액을 원심분리용 튜브에 옮긴 후, 600 x g로 10분간 1차 원심분리한다

④ 상층액을 다른 원심분리 튜브에 옮기고, 10,000 x g로 10분간 2차 원심분리한다

⑤ 침전물에 20 ㎖의 0.25 M sucrose 용액을 첨가하고 스포이드를 이용하여 재현탁한다.

⑥ 미토콘드리아 현탁액이 들어 있는 튜브를 얼음에 박아둔다. (시간이 부족할 경우에는 실험조교가 실험시간 전에 미리 ①-⑥의 준비를 한 다음, 학생들로 하여금 단계의 실험을 수행하도록 한다.)

 

2) 미토콘드리아에 의한 숙신산 산화작용 조사

① 준비된 시험관(30 ㎖) 7개에 A-G의 번호를 붙인다.

② 모든 시험관을 얼음 속에 박아둔다.

③ 각 시험관에 5 mM 메틸렌블루 용액, 0.1 M potassium phosphate 완충액(pH 7.4), 증류수, 0.1 M 숙신산 용액 등을 아래의 표에서 지시한 만큼 넣는다.

④ 간 현탁액을 아래의 표에서 지시한 만큼 재빨리 넣고 잘 섞는다.

⑤ A-F의 시험관은 30℃의 항온수조에 담그고, G의 시험관은 얼음 속에 그대로 둔다.

⑥ 각 시험관에서 메틸렌블루 용액이 완전히 탈색되는 시간을 측정한다.

⑦ 결과를 도표로 나타내고, 각 시험관의 결과를 서로 비교하며 해석한다.

 

2. 산소성호흡 (II) (세균을 이용한 실험)

1) 세균 용액 준비

① Nutrient agar 배지에서 배양한 Pseudomonas aeruginosa를 transfer loop를 이용하여 10 ㎖의 nutrient broth에 접종한 후, 30℃에서 하룻밤 배양한다.

② 배양한 P. aeruginosa의 liquid를 200 ㎖의 nutrient broth가 들어 있는 500 ㎖ 삼각플라스크에 모두 접종한 후, 30℃에서 5시간 동안 배양한다.

③ 배양액을 원심분리용 튜브(100 ㎖, 2개)에 옮긴 후, 7,000 x g로 20분간 원심분리한다.

④ 침전물에 20 ㎖의 0.1 M potassium phosphate 완충액(pH 7.4)을 첨가하고 유리막대를 이용하여 재현탁한다.

⑤ 세균 현탁액이 들어 있는 튜브를 얼음에 박아둔다.(시간이 부족할 경우에는 실험조교가 실험시간 전에 미리 ①-⑤의 준비를 한 다음, 학생들로 하여금 단계의 실험을 수행하도록 한다.)

 

2) P. aeruginosa에 의한 숙신산 산화작용 조사

① 준비된 시험관(20 ㎖) 7개에 A-G의 번호를 붙인다.

② 모든 시험관을 얼음 속에 박아둔다.

③ 각 시험관에 5mM 메틸렌블루 용액, 증류수, 0.1M 숙신산 용액 등을 아래의 표에서 지시한 만큼 넣는다.

④ 세균 현탁액을 아래의 표에서 지시한 만큼 재빨리 넣고 잘 섞는다.

⑤ A-F의 시험관은 30℃의 항온수조에 담그고, G의 시험관은 얼음 속에 그대로 둔다.

⑥ 각 시험관에서 메틸렌블루 용액이 완전히 탈색되는 시간을 측정한다.

⑦ 결과를 도표로 나타내고, 각 시험관의 결과를 서로 비교하여 해석한다.

 

3. 발효

1) 알콜발효에서 효모의 필요성 관찰

① 실험담당 조교가 1%의 포도당을 포함하고 있는 배지를 이용하여 지수 성장기 후반까지 배양한 효모(Saccharomyces cerevisiae)의 배양액과 이 배양액을 5분간 끓인 것을 미리 준비한다.

② 항온수조의 온도를 37℃로 맞춘 후, 20 ㎖용 시험관을 꽂을 수 있는 stainless steel로 만든 시험관대를 담구어 둔다.

③ 3개의 시험관(20 ㎖)에 유성펜으로 A-C라 표시한다.

④ 각 시험관에 5% 포도당 용액, 효모 배양액, 끓인 효모 배양액 등을 아래의 표에서 지시한 만큼 넣는다.

⑤ 모든 시험관은 수조에 들어 있는 시험관대에 꽂아둔다.

⑥ 1 ㎖ 피펫에 10 ㎝ 정도의 고무 튜브를 연결하고, 피펫을 A-C의 시험관에 담근 상태에서 용액을 정확히 1 ㎖가 되게 빨아올린 후, 용액이 흘러내리지 않게 집게를 사용하여 고무튜브를 잘 집어 둔다.

⑦ 각 피펫에서 용액이 처음 위치했던 부분을 빨리 표시한 후, 20분 간격으로 피펫내의 용액표면의 위치를 표시하여 시간의 변화에 따른 각 피펫 내의 용액의 감소량을 60분간 기록하여 결과를 비교한다.

 

2) 알콜발효 과정에서 탄산가스 발생 관찰

① 앞의 실험에서 사용한 시험관들을 버리지 말고 40분 정도 더 둔 다음, 각 시험관에 phenol red 용액을 몇 방울씩 떨어뜨려 색깔의 변화를 관찰한다 (Phenol red는 중성이나 알칼리성 용액에서는 분홍색 또는 붉은 색을 띄게 된다).

② 실험시간 24시간 전에 실험담당 조교가 1% 포도당 용액에 효모를 접종 한 시험관과 포도당 용액만 들어 있는 시험관에 듀람(Durham) 시험관을 넣은 후, 솜마개를 하여 37℃에 보관한다. 이 두 시험관을 실험시간에 학생들에게 보여준 다음, 각 시험관에 1 N 가성소다 용액을 충분히 넣어주고 시험관의 내부에 어떤 변화가 오는지 관찰하도록 한다.

 

3) 효모에 의한 알콜 생산

① 250 ㎖의 삼각 플라스크에 약 100 ㎖의 포도쥬스를 넣은 후, 앞의 실험에서 사용하고 남은 활발히 성장하고 있는 효모 용액을 약 5 ㎖ 첨가한다.

② 플라스크의 입구를 솜으로 막은 후, 37℃의 배양기에서 1주일 동안 보관 한다. 보관하는 도중에 하루에 한번 정도 거품의 발생 유무와 냄새의 변화를 관찰한다 (포도주 냄새가 나더라도 마시지 않는 것이 좋다).

 

 

 

[일반생물학실험]Harvesting chemical energy - Cellular respiration and fermentation 레포트