채취한 토양균의 sample을 알맞은 배지에 스며들게 접종하여 배양하는 방법을 익히고 single colony를 얻어 본다.
토양균
지표나 지하에서 생활하는 세균 및 균류의 총칭한다. 토양 중의 유기물을 분해, 질산화 작용, 탈질 작용 등 물질 순환에 큰 역할을 한다. 토양에 존재하는 미생물은 크게 세균류, 방사선균류, 균류, 조류, 원생동물로 나누어 지는데, 그 중 세균은 나머지 4가지를 합한 것보다 더 많은 부분을 차지하고 있기 때문에 매우 중요하다.
Streaking (도말)
plate에 굳힌 배지 위에 균 액을 스며들게 접종하여 배양시키는 방법이다. 그 목적은 single colony를 얻는데 있다. streaking 은 보통 병원성 미생물 실험할 때, 분리 배양한 병원성 의심균을 확인시험 하기 위해 보통배지에 특정 콜로니 하나만 따서 배양시킬 때 많이 사용하고, spreading은 병원성균의 정량실험을 할 때, 배양 후 생성된 콜로니의 수를 정확히 계 수하기 위해 많이 쓰인다.
세균의 배양 방법
1. 액체배지에 세균을 배양하는 inoculation 방법 : 증균 및 대사산물의 생산 등에 이용된다.
2. 고체배지에서 배양하는 Streaking 방법 : 세균의 보존 및 분리에 이용된다.
따라서 이번 실험에서는 고체배지를 사용함.
고체배지를 사용하는 도말법
1. 도말평판법(streak plate method)
미생물을 고형배지위에 접종하는 방법으로 획선에 의해서 균 농도가 점차로 감소하는 것을 이용한 방법.
2. 주입평판법(pour plate method) = 혼합평판법
시료를 연속적으로 희석한 후 시료의 일부를 액상의 고체배 지에 섞은 다음 평판접시에 함께 부어 고화시킨 뒤 배양한다. 이 방법을 사용하면 미생물군집이 배양기의 표면뿐만 아니라 배지 내에서도 자라게 된다.
시료의 연속적인 희석과 혼합 평판법을 이용한 생균측정 순서
희석할 때 이용되는 용액은 멸균수이지만, 식염수나 배양액을 사용하면 더 높은 회수를 나타낼 수도 있다. 희석배수는 희석의 역수이다. 도말 평판의 경우 0.1ml의 시료를 도말하기 위해 더 많은 희석과정이 필요할 수도 있다.
3. 표면도말법(spread plate method)
미생물이 함유된 한 방울의 현탁액을 고체배지 위에 멸균된 유리막대로 펼치는 방법이다. 호기성균, 통성호기성균에 적합(혐기성균, 산소 제거된 특수 용기 필요)
멸균의 목적
얻고자하는 균을 배양하는 배지에 만약 목적하는 균 외에 다른 균이 함께 배지에 있 다면 실험결과는 큰 오차를 낳을 것이다. 따라서 멸균의 목적은 오염이 안 된 배지를 얻고자 함이다. 즉, 접종하려는 균만 키우기 위해서 이다.
배지의 멸균
대체로 배지의 멸균은 고온 증기멸균법으로 행한다. 배지에 함유되어 있는 유기영양 물질은 대부분 열에 의해 파괴되는데, 고온 증기멸균하면 배지의 영양물질들이 파괴 되는 속도보다 잡균의 사멸속도가 빠르기 때문이다.
1. 고압증기멸균기의 사용법
멸균기 안의 규정선까지 물을 채운다 ➛ 살균할 재료를 담은 용기를 멸균기에 넣고 뚜껑을 닫는다 ➛ 전원 스위치를 켠다 ➛ 압력이 풀렸는지를 확인하고 온도를 100℃까지 맞춘다 ➛ 압력이 올라가면 압력을 잠그고 20분간 멸균한다.(121℃에서 15 분간) ➛ 20분이 지나면 압력을 풀어준다.
여러 가지 소독법
1. 희석에 의한 자연 소독법
희석자체에 의한 살균의 효과는 없으나 환자의 배설물과 같은 감염원이 될 수 있 는 것을 무한히 희석시키면 세균은 군락(colony)를 형성할 수 없으므로 발육이 지 연된다. 즉, 세균이 하나씩 분리되어 있을 때에는 많은 효소를 분비할 수 없게 됨 에 따라서 주위 환경으로부터 영양물질의 흡수가 지연되게 된다. 따라서, 단지 어 떤 감염원을 희석하여 주는 행위 자체만으로도 소독의 실시와 같이 균수를 감소시 킬 수 있게 된다.
2. 햇볕에 의한 자연 소독법
태양광선의 살균작용은 가시광선, 적외선 및 대기 등의 공동작용 즉, 산화에 의하 여 좌우 되어지나, 이 중에서 가장 강력한 살균작용이 있는 파장은 2900～3200Å 정도의 파장인 도모선이다. 자외선이 피하 1㎜ 깊이 까지도 살균작용을 나타낸다 고 보고되기도 했으나, 이러한 자외선은 내부 침투력이 약하기 때문에 공기를 통 과하는 동안에 공기분자에 의한 확산, 가스 특히 오존층에 의한 흡수, 매연, 운무 및 물방울 등에 의하여 그 강도가 약화되어 진다.
이와 같은 이유로 인하여 병원 미생물이 분비물, 수분 등에 들어가 있는 경우에는 태양 광선에 의한 살균시간은 지연되어 진다.
3. 한냉에 의한 자연 소독법
저온은 세균의 신진대사 기능에 필요한 호소의 촉매속도 등을 지연시키게 되므로 세균발육이 저지되기는 하나 사멸되지는 않는다. 물론, 임균, 뇌척수막염균 등 온 도조건이 까다로운 세균은 사멸되기도 한다. 따라서 저온에 의하여 살균시키고자 할 경우에는 병원성 미생물의 대부분은 저온에 대하여 저항성이 강하므로 동결과 건조법을 동시에 적용시키는 것이 보다 확실한 살균법이 될 수 있다.
4. 물리적인 살균법
멸균법
1. 화염멸균법
멸균하고자 하는 물체를 불꽃에 직접 접촉시켜 피멸균품의 표면 에 붙어 있는 미생물을 태워서 멸균시키는 방법이다. 주로 핀셋, 백금선과 같은 금속제품, 사기제품 또는 유리제품 등 불꽃으로 태워도 파괴되지 않는 물품의 멸균에 이용한다.
*소각: 화염멸균법의 일종으로서 병원 미생물에 의하여 오염된 옷, 휴지, 객담 을 담았던 용기나 쓰레기와 같은 재생의 가치가 없는 것을 불에 태워 멸균시키는 가장 쉽고 완전한 방법이다.
2. 건열멸균법
건열에 의하여 미생물을 산화 또는 탄화시켜서 멸균하는 방법이 다. 전기 건열 멸균기를 사용하고, 사용하기 전 부착한 온도계 의 정확성을 검정해야 한다. 주로 유리 주사기, 주사바늘, 메스 실린더와 같은 의료관계 초자용품. 금속제 대량의 분말과 같이 수증기가 침투되기 어려운 재료에 사용한다. 이 때, 멸균할 물 건을 가연성 물질인 종이, 천 등에 싸서 넣으면 안된다. 또 대 변, 객담, 혈액, 혈청이나 세균배지 등이 묻어 있는 것은 그대 로 멸균할 수 없고 사전에 충분히 씻어서 제거해야 한다.
3. 습열멸균법
습열에 의한 방법은 견열 멸균법에 비하여 피멸균품에 열의 전도가 빠를 뿐만 아니라, 모든 부분에 골고루 열이 전달된다. 즉, 수분이 열전도의 매체역할을 하게 된다. 또한 수분의 존재로 인하여 미생 물 단백질의 응고가 촉진되어 멸균효과가 커지게 된다.
4. 소독법
1) 끓여서 소독하는 법 : 약 100℃로 끓는 물속에 소독할 물품을 직접 담그어서 15분 이상 끓이는 방법이며 이 방법으로 완전한 멸균은 기대할 수 없으나 영양형 세포는 수초에서 수분이 내 에 사멸한다. 이때 끓이는 물에 1～2% 중조(탄산나트 륨), 1～2% 붕소, 5% 석탄산, 혹은 2～3% 크레졸 비누 액을 가해주면 세척작용, 소독력을 높이고 금속기구가 녹스는 것도 방지할 수 있다. 이 방법은 세균포자, 간 염바이러스, 원충류의 시스트(cyst)에는 효과가 없다.
2) 저온소독법 : 소독할 대상의 영양성분 파괴방지나 맛의 변질을 막고 결핵균, 소의 유산균, 살모넬라균 및 구균들의 감염방지를 목적으로 우 유를 소독하거나 술 종류의 부패 방지에 이용된다. 일반적으로 소독 온도와 시간은 62～63℃에서 30분 동안, 아이스크림원료는 80℃에서 30분, 건조과일은 72℃에서 30분, 그리고 포도주는 5 5℃에서 10분간 가열 소독한다.
5. 고압증기멸균법
현재 가장 널리 이용되고 있는 멸균법으로 100～135℃ 고온의 수 증기를 미생물, 포자 등과 접촉시켜서 가열 처리하는 방법이다. 고압멸균장치가 필요하며 세균에 작용하는 열기는 단순한 열 뿐 만 아니라 멸균에 충분한 온도를 포함한 포화 증기인 기체라는 것이 특징이다. 멸균 물품에 잔류 독성이 없고, 포자를 사멸시키 는데 소요되는 멸균시간이 짧다는 장점이 있지만 100℃ 이상의 온도에서 견딜 수 없는 물품과 수증기가 통과되지 못하는 것은 멸균할 수 없는 단점도 있다.
∴ 열원으로서 수증기를 사용하는 이유
․열용량이 크다.
․일정온도에서 쉽게 열을 방출한다.
․청결하고, 냄새가 없고 무해하므로 사용하기가 좋다.
․미세한 공간에도 침투성이 좋다.
․대량으로 발생시킬 수 있을 뿐만 아니라 발생시키는 비용도 싸다.
6. 증기멸균법
고압증기멸균법에 의한 가열온도에서 파괴될 수 있는 물품을 멸 균할 때 이용되는 방법으로 보통 3회정도 가열하게 된다. 첫 번 째 가열에서는 영양형 세포로 사멸시키고, 첫 번째 가열 수 2 0℃ 이상의 실온에 방치하는 동한에 포자는 발육하여 저항력이 약한 영양형으로 변화되어 2～3회째에 가열에 의하여 사멸되게 되며, 포자가 많이 포함된 재료의 멸균 방법으로는 부적절하다.
7. 가스 멸균법
멸균제를 가스상태 혹은 공기중에 분무상태로 분부시켜 미생물을 멸균시키는 화학적 살균의 특수한 방법이다. 이것은 고형재료, 기구, 장치, 식품 및 밀폐공간 등에 존재하는 미생물을 사멸시킬 목적으로 이용되고 있다. 가스 멸균은 수분과 가열로 멸균시킬 수 없는 경우에 적용되어지는 냉멸균이며 빈번하게 실제로 사용되어 온 것은 포름알데히드, 에틸렌 옥사이드, 프로필렌 옥사이드 및 베타프로피오락톤 등 에 불과하다.
8. 자외선 살균법
자외선은 주로 저전압 수은램프를 이용하여 살균력이 강한 260～280㎚의 전자파를 방사시켜서 멸균하는 방법이다. 사용 용도는 무균조작실, 수술실, 식품저장 창고 및 병원 등에서 널리 사용되고 공기나 물의 살균에도 이용되며 특히 최근 들어서 바이러스 연구실의 무균 작업대 혹은 조직 세포 배양실 등에 흔히 사용된다. 그러나 내부 침투력이 약하기 때문에 살균작용이 주로 표면에서 일어난다.
실험 기구 및 시약
1. 실험 기구
1) LB plate, 백금이, Alcohol lamp, 37℃ incubator, petri dish, micro pipette, clean bench
2. 실험 시약
1) 70% Ethanol, 토양 sample, dH2O(3차)
2) Nutrient agar 배지 (세균) : beef extract 3g, peptone 5g, agar 15g (g/L)
3) Czapek-Dox agar 배지 (곰팡이) : NaNO3 3g, K2HPO4 1g, MgSO4·7H2O 0.5g, KCl 0.5g, FeSO4·7H2O 0.1g, Glucose 30g, agar 15g (g/L)
실험 방법
1. 도말평판법(streak plate method)
① 실험대나 손은 70% ethanol 로 소독한 후 실험한다.
② 백금이가 빨갛게 될 때까지 알코올 램프로 멸균하고, 충분히 식힌다.
③ 균주가 담긴 시험관의 입구과 마개도 멸균한다.
④ 멸균한 백금이를 균주가 담긴 시험관에 넣어 균주를 살짝 묻힌다.
⑤ 균주가 묻은 백금이를 이용해 배지의 위쪽 1/3 가량을 도말한다
⑥ 백금이를 다시 불꽃으로 멸균하여 식힌 다음 1차 도말한 부분과 일부 겹치도록 재도말한다.
⑦ 백금이를 다시 불꽃으로 멸균하여 식힌 다음 2차 도말한 부분과 일부 겹치도록 재도말 한다.(3차 도말한 부분이 1차 도말한 부분과 겹쳐서는 안된다)
⑧ 도말이 끝난 배지는 인큐베이터에서 배양한다.
2. 표면도말법(spread plate method)
① NA배지에 접종할 균주의 명을 기재한다.
② 2.95%에탄올이 담긴 비커에 삼각 유리봉을 구부러진 부분까지 충분히 담근다.
③ 에탄올로 소독한 유리봉을 알코올램프의 불꽃에 통과시켜 묻어있는 에탄올을 태운다. 배지에 닿을 부분이 아래로 향하게 하여 불꽃을 통과시키고 10~15초 식힌다.
④ 피펫으로 배양액을 피페팅하여 배지의 표면에 주입한다.
⑤ 배지표면의 배양액을 멸균한 삼각 유리봉으로 골고루 가볍게 밀어 퍼지게 한다.
⑥ 도말이 끝나면 배지 뚜껑을 닫아 뒤집어 항온기에서 보관한다. 이 때 항온기의 온도가 25도에서는 48~72시간, 37도에서는 24~48시간 정도 배양한다.
생균측정. 생균 측정(평판법)을 수행하기 위한 두가지 방법. 두가지 경우 모두 평판에 시료를 넣기 전에 대개 시료를 희석한다. 혼합 평판법의 경우 집락이 어떻게 배지의 표면 뿐 아니라 속에서도 형성이 되는지 주시하자.
주의 사항
1. 백금이를 불꽃으로 충분히 멸균한 후, 충분히 식혀서 사용한다. 식히지 않을 경우 도 말해야 할 포자까지 멸균되고 배지가 녹을 수 있다.
2. 백금이의 표면을 세척하여 매끄러운 상태를 유지해야 한다. 매끄럽지 않으면 배지가 파일 수 있다.
3. 배지는 충분히 굳히고 말린 다음 사용한다. 잘 마르지 않은 배지는 물방울이 배지 표 면에 떨어져 콜로니를 서로 겹치게 한다.
4. 유리병에 묻은 에탄올을 태울 때 너무 오래 불꽃으로 멸균하지 않도록 한다.
5. 유리병으로 도말할 때에는 배지의 표면이 파이지 않도록 힘을 가볍게 주도록 한다.
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