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  생명과학실험 | 단백질 분리정제 및 기능분석 TIP 1. DEAE Sepharoge anion exchange chromatography를 통한 단백질 분리 2. Column chromatography를 이용하여 Alkaline phosphatase를 분리한다. AP의 정제과정 1. AP가 outer membrane과 inner membrane 사이에 존재하는 경우, osmotic shock을 주어 outer membrane만 깨지게 한다. 2. Spheroplast 상태일때 centrifuge를 하면 supernatant와 pelet으로 분리된다. (이때, AP는 sup. 에 존재한다) 3. AP의 크기를 이용하여 dialysis를 하여 size 별로 분리한다. Bovine의 경우는 homodimer상태로 kDa=160-180 이다. 4. Bov.. Biology/생명 과학 | 공학 2022. 11. 2.

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  생명과학실험 | Tris-HCl buffer 만들기 TIP 1. Column chromatography의 준비로서의 buffer만들기 2. 1M의 Tris-HCl (pH7.4), NaCl, MgSO4 Stock solution을 제조한 후 다양한 NaCl 농도의 elution buffer를 만든다. Buffer solution Buffer solutions는 적은 양의 산이나 염기를 첨가하거나 희석시킬 경우, 용액의 H+와 OH-의 농도 변화를 줄이기 위해 사용하는 용액이다. Buffer solutions는 약산과 그것의 짝염기로 이루어진 것이 일반적이며, 약염기와 그것의 짝산으로 이루어진 경우는 전자보다 적다. 용액의 pH변화에 저항하는 buffer solutions의 기능은 앞서 말한 약산과 그 짝염기의 평형에 의한 결과로, Le Chatelier의 .. Biology/생명 과학 | 공학 2020. 9. 7.

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  생명과학실험 | Specific activity and enzyme kinetics of alkaline phosphatase TIP 효소의 활성도를 흡광도를 이용하여 측정하는 방법과, specific activity의 개념을 이해하고, enzyme kinetics에서 기본이 되는 M-M equation과 Linear-burk equation을 이용행서 효소활성의 척도가 되는 Km,Vmax,kcat 등을 실험적으로 측정한다. Specific activity of Enzyme 단위 질량 당 효소의 활성을 말하며, 효소활성을 단백질의 단위중량당으로 나타낸 것. 일반적으로 활성의 단위는 비〔U/㎎〕로 나타낸다. 효소 이외의 불순한 단백질이 적을수록 비활성이 높아지기 때문에 효소정제의 척도가 된다. 효소의 정제 순도가 높을수록 specific activity가 증가한다. 실험 방법 1. Bradford assay (단백질 정량) 1) .. Biology/생명 과학 | 공학 2019. 11. 6.

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  생명과학실험 | Alkaline phosphatase의 정제 TIP Ion-exchange chromatography에 의한 단백질 정제 원리를 이해하고, DEAE anion exchange column을 이용한 AP 단백질의 정제기법을 습득하게 된다. Alkaline Phosphatase(AP) Phosphatase는 인산화 되어 있는 분자에서 인산기를 제거하는 효소이다. 대개 생체내의 효소는 특정한 기질과만 반응하는 기질 특이성을 지니는데, AP같은 경우에는 특정한 기질과만 반응하지 않는 nonspecific phosphatase에 해당한다. 이름에 alkaline이 붙는 이유는 이 효소가 작용할 수 있는 최적의 환경이 염기성이기 때문이다. AP는 보통 homo-dimer로 작용하며 크기는 140-160 kDa정도이다. (-)charge를 띠며, 75～85℃의.. Biology/생명 과학 | 공학 2019. 10. 9.