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  생화학실험 | PCR-Mediated Mutagenesis TIP PCR의 종류와 원리에 대해서 알아보고 PCR-mediated deletion 실험을 통해 DNA의 원하는 부위를 제거하여 증폭할 수 있다. Site-directed mutagenesis Site-directed mutagenesis는 특정 DNA 염기서열에 돌연변이를 도입하는 기법으로 분자생물학의 핵심기술이다. PCR을 응용한 다양한 site-directed mutagenesis 기법이 개발되었으며 계속 진화하고 있다. 이를 "PCR-mediated site-directed mutagenesis"라고 한다. 최근 가장 진화한 형태인 "overlap extension PCR"이 널리 이용되고 있다. Overlap extension PCR은 돌연변이(substitution, insertion, an.. Biology/생화학 2020. 2. 10.

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  분자생물학실험 | RNA Isolation and analysis TIP 세포에서 RNA를 추출하기 위해서 RNA를 RT–PCR 하여 cDNA 상태로 만들고 cDNA를 PCR 하여 sample을 loading 하고 band를 확인하기 위함이다. RNA 추출 원리 포유세포는 보통 한 세포 당 10-5㎖ RNA를 포함하고 있으며 이 중 80∼85%가 rRNA, 15∼20% 가 tRNA, 1∼5%가 mRNA로 이루어져 있다. 리보솜 RNA나 tRNA 등은 일정한 크기와 염기서열을 가 지고 있기 때문에 전기영동, 초 원심 분리 및 크로마토그래피에 의해 순수하게 분리할 수 있는 반면, mRNA는 크기도 다양하고 많은 종류가 혼합되어 있기 때문에 한 종류의 mRNA를 순수 분리하기가 쉽지 않다. 그러나 진핵세포 mRNA는 3말단에 poly(A)를 가지고 있기 때문에 리보솜 RNA.. Biology/분자생물학 2020. 2. 10.

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  분자생물학실험 | Real–Time PCR TIP real-time PCR의 기본원리를 이해하고, 직접 real-time PCR을 수행하여, DNA를 많은 양으로 증폭시킨다. DNA polymerase (DNA 중합 효소) PCR의 반응은 DNA 중합효소에 연관되어 있으며 좋은 효소를 선택하는 것이 좋은 결과를 얻기 위해서 중요하다. 낮은 온도에서 나타나는 Taq DNA 중합효소의 활성이 PCR 반응의 특이성에 영향을 미치는 원인 중 하나다. 이러한 경우 primer는 DNA에 비특이적으로 결합하게 되며 비특이적인 산물을 만들어내게 된다. 이러한 문제를 최소화하기 위해서 “hot-start” 기능을 가진 효소를 사용해야 하는데 이 효소는 낮은 온도에서나 초기 DNA denature 과정에서의 Taq의 활성을 억제하게 되어 이러한 비특이적인 산물을.. Biology/분자생물학 2020. 1. 6.

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  생화학실험 | PCR & DNA Gel Electrophoresis TIP 1. PCR을 이용하여 DNA를 증폭한 후 Agarose gel electrophoresis를 통해 DNA를 분리한다. 2. PCR의 원리를 이해하고 전기영동에 이용된 시약의 특성을 이해한다. PCR 유전자를 분석하고 연구하는데 있어서 가장 큰 문제점은 복잡한 전체 genome중에 연구 하고자 하는 유전자가 희귀하다는 것인데, PCR은 특정 DNA Sequence의 copy수를 기하 급수적으로 증폭시킬 수 있다는 점이다. 이러한 PCR을 소개하기에 앞서서 간단히 분자 생물학적인 사항을 review해 보면 먼저 DNA의 구성을 살펴보면, DNA는 다음과 같이 phosphate group(인산기) - sugar(당) - base(염기)의 세 가지 요소로 구성되는 nucleotide라는 모듈이 쌍으로 .. Biology/생화학 2019. 10. 18.