생명과학실험 | Enzyme-linked immunosorbent assay

 

 

 

TIP

 

 

실험을 통해서 어떻게 ELISA가 작용하는지 알아 보자. 또한 specific protein-protein interaction을 이해해 보자.

 

 

 

Enzyme-linked immunoassay (ELISA, 효소결합면역흡착검사)

antibody를 이용하여 색깔의 변화를 관찰하고 그 결과를 통하여 antigen이 sample내에 존재하는지를 판별하는 실험법이다. 이 실험 법은 indirect ELISA, direct ELISA, sandwich ELISA 이렇게 3가지 종류가 있다. 이제 이 세가지 실험법들이 어떻게 다른지에 대하여 알아보자.

 

ELISA의 보편적인 실험 원리는 다음과 같다. Protein이 잘 흡착되는 well의 바닥에 알아보고자 하는 antigen이 들어 있는 sample을 넣고 흡착 시킨다. 빈 공간에 항체가 흡착 될 수 있기 때문에 blocking을 해주어 빈 공간을 채워 준다. 이제 antigen에 특이적으로 결합하는 primary antibody를 넣어 준다. 이후 계면활성제를 넣어 혹시 있을지 모르는 비 특이적 결합을 제거하여 준다.

 

이때 Direct ELISA는 primary antibody에 enzyme이 붙어 있는 것으로 indirect ELISA와는 달리 secondary antibody가 필요 없고 이 단계에서 바로 enzyme과의 반응을 통해 색을 띄는 substrate을 넣어 antigen의 존재 여부를 확인 할 수 있다. 그러나 이 경우 반응의 증폭이 이루어 지지 않은 상태이기 때문에 반응이 indirect ELISA에 비하여 약하다. 또한 실험마다 실험할 antigen이 다르고 enzyme이 다른데 direct ELISA에서는 primary antibody에 enzyme을 달기 때문에 매 실험 마다 antibody와 enzyme의 조합을 다르게 해 주어야 하는 상황이 발생 한다.

 

Antibody는 비싸기 때문에 이 경우 경제적 문제가 발생 할 수 있다. 그리고 아까 넣었던 primary antibody에 특이적으로 결합하는 secondary antibody를 넣어 반응을 증폭 시켜 준다. 그리고 enzyme과의 반응을 통해 색을 띄는 substrate을 넣어 antigen의 존재 여부를 확인하여 준다. 이때 indirect ELISA는 secondary antibody에 enzyme이 붙어 있는 것으로 direct ELISA보다 경제적이며 secondary antibody를 이용하는 과정에서 반응의 증폭이 일어나기 때문에 antigen의 유무를 좀더 정확히 판별할 수 있다.

 

그리고 마지막으로 sandwich ELISA는 well에 capture antibody를 먼저 코팅 한 뒤에 antigen을 넣어 준다. 그러나 indirect ELISA는 well에 antigen을 직접 흡착 시키고 실험을 진행된다는 면에서 다르다. 이 이후는 indirect ELISA와 같은 방식으로 진행 된다. Sample에 불순물이 많이 섞여 있는 경우에 이와 같은 방법으로 실험을 진행하게 되면 antigen에 대한 특이성이 높아진다는 장점이 있다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) 전 실험에서 측정한 smaple의 농도를 이용하여 0㎍/㎖, 5㎍/㎖, 10㎍/㎖ 농도의 antigen을 sample을 통해 만들고 vortex와 centrif㎍ation을 해준다.

 

2) 만든 세 종류의 antigen 25㎕를 다음과 같이 12개의 well에 4번씩 넣는다.

 

 

3) Antigen을 넣고 antigen coating이 될 때까지 1시간 기다린다.

 

4) 물로 well을 채워서 washing

 

5) 1% BSA용액을 PBS에 섞은 blocking buffer를 200㎕씩 각 well에 넣어 RT에서 1시간 동안 blocking 해준다.

 

6) 흐르는 물로 well을 채워서 3회 washing한다.

 

7) Primary antibody를 다음과 같이 12개의 well중에 위에 6개에만 25㎕씩 넣어 주고 RT에서 1시간 동안 기다린다.

 

 

8) 각 well당 PBS-T를 200㎕씩 넣어 washing 해 준다.

 

9) Pipet으로 well의 바닥 모서리 부분의 남은 잔여물을 빨아 들여 준다.

 

10) Secondary antibody 를 25㎕씩 모든 well에 넣어준다. 그러면 well은 다음과 같은 구성이 된다.

 

 

11) 8)과 9)의 과정을 반복 한다.

 

12) TMB substrate를 25㎕씩 각 well에 넣어준다.

 

13) TMB를 넣고 색의 변화가 적당히 일어나면 넣은 순서와 속도를 동일하게 하여 25㎕를 넣어준다.

 

14) 450㎚에서 흡광도를 측정한다.

 

 

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