ELISA
ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)는 그 방법이 간단하고 비용이 많이 들지 않으며 다량 분석이 가능하여 현재 가장 널리 쓰이고 있는 Ag-Ab 분석법의 하나가 되고 있으며, Ag-Ab interaction을 이용하여 Ag 또는 Ab를 정성, 정량 할 수 있다.
효소결합 면역흡수 분석법, 즉 ELISA는 효소의 작용을 이용해 특정효소와 결합할 수 있는 면역글로불린(immunoglobulin)의 존재를 확인할 수 있다.
항체에 결합되는 효소 중에는 간단한 기질 용액을 넣어주면 색깔을 띄는 반응을 하게 되는데, 대표적인 효소로는 염기성인산분해효소 (alkaline phosphatase)나 양고추냉이과산화효소 (HRP, horseradish peroxidase) 등이 많이 이용되고 있다. 이들 효소는 항체분자의 Fc 지역에 공유결합 되도록 화학반응을 이용하여 결합시켜 사용한다
이 면역학적 검사방법은 항체분자에 효소를 공유결합으로 부착시켜 높은 특이성과 민감도를 가지기 때문에 감도가 매우 우수한 실험방법이며(0.001-0.01㎍/㎖까지 측정가능), 임상적으로도 쓰이고 있다. 특히 ELISA는 방사능면역시헙법(RIA, Radio Immuno Assay)과 같이 매우 민감한 반응이면서도 RIA에서처럼 방사능을 사용하지 않는다는 장점이 있어서 그 사용이 증가되고 있다.
ELISA의 원리
Antigen-antibody 반응을 이용하여 항체가 특정 항원을 인식하여 결합하는 원리를 이용한 것이다.
흡광도를 잴 때와 마찬가지로 농도에 따라 색의 진하기가 다른 standard를 기준으로 Growth Curve를 만들고, well에 넣은 샘플과 well에 이미 붙어 있던 antibody의 결합이 많으면 많을수록 색이 진하게 나오게 하여, 샘플에 있는 특정물질의 농도를 알아내는 것이다. (흡광도로 측정)
ELISA의 종류
ELISA의 종류는 ‘Competitive ELISA’, ‘Indirect ELISA’, ‘Sandwich ELISA’가 있다.
① Competitive ELISA
A. 이 방법은 처음 항체를 용액 내에서 항원을 함유하는 시료와 배양한다. 그런 다음 항원-항체 혼합물을 항원이 부착된 측정판 구멍에 넣는다.
B. 시료에 들어 있는 항원의 양이 많을수록 더 작은 양의 자유 항체가 구멍에 부착된 항원과 결합 할 수 있을 것이다.
C. 일차 항체의 동형에 특이한 효소-연결 이차항체를 가하면 ‘Indirect ELISA’와 같이 구멍에 부착된 일차 항체의 양을 결정할 수 있다.
‘Competitive ELISA’에서는 원래 시료에 들어 있던 항원의 농도가 높을수록 흡광도는 낮게 기록될 것이다.
② Indirect ELISA
A. 항체를 검색하거나 그 양을 결정 할 수 있다. 일차 항체를 함유하는 혈청 또는 기타 다른 시료를 항원이 부착된 측정판에 넣고 항원과 반응 시킨다.
B. 부착되지 않은 1차 항원을 씻어내고 일차항체와 결합할 수 있는 효소가 연결된 이차항체를 넣어 항원에 결합된 항체의 존재를 검출한다.
C. 그런 다음 부착되지 않은 2차항체를 씻어내고 효소에 대한 기질을 넣어준다. 형성된 유색 반응산물의 양은 분광광도측정기로 측정한다.
Direct ELISA는 후천성면역 결핍증의 원인체인 사람 면역결핍바이러스(HIV)에 대한 혈청항체의 존재를 검출하는 데 가장 적합한 방법이다.
③ Sandwich ELISA
이 기법은 항원 대신에 항체를 측정판 구멍에 부착시켜 사용한다.
A. 항원이 함유된 시료를 넣고, 부착된 항체와 반응하도록 한다. 이때 사용하는 이차 항체는 동일한 항원에 존재 하지만 일차 항체가 인식하는 항원결정기와는 다른 결정기에 특이한 항체를 사용한다.
B. 부착되지 않은 이차 항체를 씻어 낸 후, 기질을 첨가하고 유색의 반응 산물을 측정한다. (Figure 12)
항원의 양이 적을 때 또는 미지의 샘플에 들어 있는 항원을 조사할 때 사용한다.
Sandwich ELISA 실험 방법
sandwich ELISA는 capture antibody 와 detection antibody사이에 antigen의 양을 측정하는 방법이다.
Antigen은 antibody가 binding할 수 있는 최소한 2개의 antigenic site를 가지고 있기 때문에 최소한 2개의 antibody를 필요로 한다. Monoclonal 또는 polyclonal antibodies 모두 capture 와 detection antibody용으로 이용될 수 있는데, monoclonal antibodies는 single epitope을 인지하고 있기 때문에 antigen 사이에 미세한 차이도 quantification 혹은 detection이 가능하다.
Polyclonal antibodies 경우는 보통 capture antibodies로 가능한 많은 antigen을 pull down할 수 있게 이용된다.
Sandwich ELISA 의 장점은, 분석하기 전에 sample을 purify하지 않아도 되며, direct나 indirect방법에 비해서 2-5배 정도 민감하다는 것 이다.
① Sandwich ELISA 실험 과정
A. Coating with capture antibody
1) capture antibody를 1-10 ㎍/㎖ (in carbonate/bicarbonate buffer (pH7.4)) 농도로 coating합니다.
2) overnight at 4°C에서 반응 시킵니다.
3) coating solution을 제거하고, plate을 200 ㎕의 PBS로 3번 washing한 뒤에, 남은 PBS는 가볍게 톡톡 치거나, paper towel로 닦아서 제거해 줍니다.
B. Blocking and adding samples
1) 200㎕ blocking buffer, (5% non fat dry milk or 5% serum in /PBS)을 각 well에 넣어줍니다.
2) 2 시간 동안 room temperature 또는 4°C 에서 overnight at 하여 incubation합니다.
3) diluted samples을 약 100 ㎕ 정도 각 well에 첨가합니다.
4) 90분 동안 37°C에서 반응 시킵니다.
5) Samples을 제거하고, 200 ㎕ PBS로 2번씩 washing 해 줍니다.
C. Incubation with Detection antibody and then Secondary antibody
1) antibody의 datasheet에 나와있는 조건에 따라서 적절히 희석을 한 후에 100ul 의 detection antibody를 넣어줍니다.
2) Room temperature에서 2 시간 또는 4°C 에서 overnight Incubation 합니다.
3) PBS로4번 washing합니다.
4) 100㎕ 의 conjugation 된 secondary를 적절한 농도에 따라 넣어줍니다.
5) room temperature 에서 1~2시간 동안 incubation 시킵니다.
6) PBS로 4번 washing해 줍니다.
D. Detection
1) 100 ㎕(or 50 ㎕)의 substrate solution을 첨가합니다.
2) 충분히 발색이 되면 100 ㎕의 stop solution을 각well에 첨가합니다.
3) OD 값을 plate reader로 측정합니다.
② 각 실험 단계마다 특징과 주의할 점
A. The Solid Phase
항원 및 항체는 solid phase에 흡착되는데 이것은 test중에 면역 반응이 일어난 것과 그렇지 않은 것을 구분하는 첫 번째 단계이며, 그 흡착되는 양을 충분히 하여 반응물질의 양을 소화 할 수 있도록 할 필요가 있다.
특별히 고안된 polystyrene으로 만들어진 microplates가 널리 사용되며, 대부분의 항원과 항체의 흡착에 있어서 재현성 및 높은 효율을 제공한다.
B. Materials for coating solid phase
Solid phase에 coating하기 위한 최적 조건을 얻기 위해서는 reactant의 농도, coating시간, 온도 그리고 pH를 고려해야 한다. 대부분의 단백질과 지질 단백질은 Bicarbonate buffer, pH 9.6 에서 약 1~10㎍/㎖의 농도가 적당하다.
흡착은 20~25℃에서 1~2시간 안에 거의 완전히 일어나며, 편의를 위해 4℃에서 overnight 하는 방법이 사용된다. Coating된 plate는 완벽히 dry된 상태에서 밀봉되어 보관되어야 한다.
C. Washing step
Washing step은 ELISA법에 있어서, sample내의 분석하고자 하는 물질과 solid phase에 흡착된 단백질 사이에 혹은 그 물질과 Conjugate 사이에 면역반응이 일어난 것과 일어나지 않은 것을 구분하는 가장 중요한 단계다. 분석 방법의 design에 따라 test중 washing step의 횟수가 달라진다.
Washing액으로는 tween20가 포함된 PBS가 대부분 사용된다.
D. Test Sample
ELISA법에 있어서 sample로 사용되는 serum. plasma, CSF, saliva 등은 그 안의 어떠한 물질로 인하여 non-specific 반응을 일으키는 경우가 있다.
이러한 non-specific 반응을 막기 위해서 wetting agent(e.g. Tween20)가 포함되어있는 buffer(e.g. PBS)로 희석하고 그러한 반응으로 인한 background를 가능한 한 최소로 하기위해서 protein(e.g. Albumin)이 첨가된다.
또한 rheumatoid factor가 포함되어있는 serum이나 plasma의 경우에는 그 안의 다른 물질(e.g. specific IgG Antibody)과 반응하여 solid phase에 고정될 수 있다. 이러한 경우에는 chromatographic 또는 centrifugal separation을 통해 IgG나 IgM을 제거하는 것이 좋으며, 정량분석의 경우에 분석을 요하는 물질이 매우 높은 농도로 존재하는 sample은 "hook effect"를 보일 수 있으므로 적당한 비율로 희석하는 것이 필요하다.
E. Conjugates
매우 다양한 enzyme이 항원이나 항체와 결합되어 conjugate로 사용되고 있는데, 이러한 conjugate로 사용되기 위해서는 안정성, 높은 반응성, 정제도 그리고 안정된 conjugate의 구조 등이 요구된다. 사용되는 enzyme중에 이러한 특성을 고려하여 Alkaline phosphatase와 Horse-radish peroxidase가 가장 널리 이용된다.
F. Substrate
Conjugate에 사용된 enzyme과의 민감한 반응이 substrate로서 가장 요구되는 점이다. 대부분 처음에는 무색투명하고 degradation됨으로서 강한 색을 나타내는 chromogenic substrate를 사용하는데, 완전히 soluble한 상태가 높은 효율을 위해서 이상적이며, 경제적이고 안정적이며 사용이 용이해야 한다.
Alkaline phosphatase의 경우 p-nitrophenyl phosphate가 substrate로 사용되고 peroxidase의 substrate는 H2O2에 의해서 산화된다.
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