면역학실험 | ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay)

TIP

 

 

1. 실험을 통해 ELISA가 어떻게 수행되어지고 진단 테스트에 적용되는지 배운다.
2. antigen-antibody, receptor-ligand, enzyme-substract 간의 특정한 protein-protein interaction에 대해 이해할 수 있다.

 

 

 

ELISA

효소면역측정법이라 불리는 ELISA는 sample에서 antibody나 antigen의 존재를 찾는데 사용되는 생화학적 방법이다. antigen-antibody 반응을 enzyme 표지를 이용하여 enzyme에 대한 substrate를 첨가하여 antigen-antibody 결합체에 붙은 enzyme의 양을 enzyme이 substrate에 대해 작용하여 발색반응이 일어난 정도를 분광 광도계로 측정함으로써 정량하는 방법이다. 순수과학 응용과학 모든 분야에서 사용되고 있는데 특히 진단생물학에 많이 쓰 인다. antigenic 자극에 대한 반응으로 동물에서 만드는 antibody를 이용하여 그 antibody를 만든 antigen을 찾아 내는 데 쓰일 수 있고 반대도 가능하다.

 

항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 반응을 확인하는 방법으로, 그 방법이 간단하고 비용이 많이 들지 않으며 다량 분석이 가능하여 현재 가장 널리 쓰이고 있는 항원-항체 분석법의 하나가 되고 있다. 특히 이 방법은 방사능면역시헙법 (RIA, Radio ImmunoAssay)고 같이 매우 민감한 반응이면서도 RIA에서처럼 방사능을 사용하지 않는다는 잇점이 있어서 그 사용이 증가되고 있는 방법이다. 항체에 결합되는 효소 중에는 간단한 기질 용액을 넣어주면 색깔을 띄는 반응이 이용되는 데, 이들 효소는 항체분자의 Fc 지역에 공유결합되도록 화학반응을 이용하여 결합시켜 사용한다.

 

대표적인 효소로는 염기성인산분해효소 (alkaline phosphatase)나 양고추냉이과산화효소 (HRP, horseradish peroxidase) 등이 많이 이용되고 있다.

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) AP coation하기

① 0.985㎍/㎕인 AP용액을 일정농도로 희석하여 200㎕를 만든다.

② 실험을 duplication으로 진행하기 위하여 96well 중 12개의 well을 지정하고 각 위치에 맞는 coating buffer로 상온에서 1시간동안 coating한다. 아래 1,2에는 PBS만 25㎕씩 3,4에는 1)의 a용액을 25㎕씩 5,6에는 1)의 b용액을 25㎕씩 넣는다.

 

 

2) coating이 끝나면 coating buffer를 버리고 물줄기가 coating한 부분에 직접 닿지 않도록 물을 흘리면서 washing한다.

3) 1% BSA를 25㎕넣고 상온에서 1시간 또는 4℃에서 o/n동안 blocking한다. blocking이 끝나면 2)방법과 같이 blocking buffer를 버리고 washing한다.

4) 1:500으로 희석된 1° Ab를 1,3,5에 25㎕씩 넣는다. 2,4,6에는 PBST를 25㎕넣고 상온에서 1시간동안 incubation 한다.

5) 시간이 지나면 1° Ab 용액을 따라내고 PBST를 이용하여 well에 넘치게 흘려서 3번 washing한다.

6) 1:2000으로 희석된 2° Ab를 모든 well에 25㎕씩 넣고 상온에서 1시간동안 incubation한다.

7) 시간이 지나면 마.와 같은 방법으로 3번 washing한다.

8) TMB를 25㎕넣어 각 well의 반응정도를 관찰한다.

9) 반응이 어느 정도 일어났다고 판단되면 H₂SO₄를 25㎕첨가하여(총 용액의 양이 50㎕가 된다.) 반응을 stop시킨 다.

10) VersaMax Microplate reader로 450㎚에서 흡광도를 잰다.

 

 

 

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