생화학실험 | Western Blot

 

 

 

TIP

 

 

항원에 대한 항체의 특이적 결합을 이용하여 단백질 혼합물로부터 어떤 특정 단백질을 분석하는 western blot의 원리를 이해하고, 단백질의 SDS-PAGE분리, 단백질의 gel로부터 membrane으로의 transfer, 항체반응 및 항체에 부착된 효소의 반응에 의한 발색반응 등의 실험기법을 습득한다.

 

 

 

Immunoblot(western blot)의 원리

immuno blot이라고도 부르는 western blot은 antigen과 antibody사이의 특이적인 결합을 이용하여 시료 속에 위치한 단백질을 정성적/정량적으로 분석하는 방법이다. 단백질이 transfer되어있는 membrane에 원하는 단백질의 antibody를 넣어주면 항원 항체반응을 일으켜 antibody가 원하는 단백질 band에 붙게 된다.

 

이때 항체에는 효소가 결합되어있어 항원-항체 반응이 끝난 후 효소에 대한 기질을 넣어주면 효소가 있는 곳에서만 기질 반응이 일어나게 된다. 이러한 기질 반응은 색을 발하거나 형광을 발하는 침전물을 membrane 효면에 침전시킴으로써 검출이 가능하게 된다. 가장 민감한 검출방법은 chemieluminescent 기질을 이용하는 방법이다. 이 방법으로 주어진 시료에서 특정 단백질의 유무를 검출할 수 있고, band의 두께를 수치화 하여 단백질의 양도 알 수 있다.

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실험 방법

1. 실험 과정

1) SDS-PAGE를 통해 단백질을 크기별로 분리해 낸다.

SDS-PAGE 과정은 생략합니다. SDS-PAGE를 통해 단백질을 크기별로 분리

 

2) memabrane transfer

SDS-PAGE가 끝나면 만들어진 gel안의 단백질들을 Nitrocellulose membrane에 transfer한다. cassette에 membrane과 gel을 보호하기 위해 스펀지를 깔고 그 위에 3M paper를 깐 뒤 membrane을 올리고 gel을 올린다. 위에다시 3M paper, 스펀지를 놓고 뚜껑을 덮는다. 이 과정에서 기포가 들어가지 않게 주의한다. 이때 membrane을 수직으로 눌러야 band가 휘어지지 않는다. gel에 cathode를 걸어 주고 membrane에 anode를 걸어주어 electrophoretic transfer한다.

transfer buffer: 25mM Tris Base, 192mM glycine, 20% methanol

 

3) blocking(30분)

transfer가 끝난 membrane을 blocking solution으로 상온에서 30분 흔들어 주면서 blocking 한다.

blocking solution: TTBS(Tween-Tris buffered saline) -20mM Tris pH 7.6, 130mM NaCl, 0.1% Tween20 +5%(W/V) skim milk (nonfat dry milk)

milk를 washing buffer에 녹인 용액을 blocking solution으로 쓴다.

 

4) frirst antibody붙이기 (1hr)

skim milk가 들어있는 TTBS에 primary antibody를 넣은 solution에 membrane을 넣고 shaker로 흔들어주면서 상온에서 1시간, 또는 4℃에서 overnight incubation 한다. primary antibody: anti AP (mono clonal antibody)

 

5) washing(5×3)

TTBS로 membrane을 5분씩 세 번 wash 한다. washing buffer: TTBS(Tween-Tris buffered saline) -20mM Tris pH 7.6, 130mM NaCl, 0.1% Tween20

 

6) second antibody(30분) 붙이기

5% skim milk가 들어있는 TTBS에 AP conjugated secondary antibody를 넣은 solution에 membrane을 넣고 상온에서 1시간 동안 shaker로 흔들어주며 membrane을 incuation한다. anti monoclonal AP antibody에 HRP(Horse radish peroxidase)를 conjugation 시켜 사용한다.

 

7) washing

TTBS로 membrane을 5분씩 세 번 wash 한다.

 

8) substrate 붙이기

HRP와 반응을 하는 TMB (tetramethyl benziodine)을 넣고 band가 나타날 때까지 반응시킨다. (5～15분 정도 걸린다)

 

9) band가 나타나면 물로 wash해서 반응을 멈춘다.

 

 

 

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