분자생물학실험 | Protein assay and Western blot

 

 

 

TIP

 

 

1. Protein assay : Cell에서 protein을 추출하는 과정을 이해하고, protein assay(BCA method)을 이용하여 단백질의 함량을 측정할 수 있음을 이해한다.
2. Western blot : Protein sample을 membrane에 transfer하고, Western blot을 통하여 항원-항체 반응을 유도하여 원하는 특정 단백질을 detection 할 수 있음을 이해한다.

 

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) 10% SDS gel 만들기

 

2) Protein assay

① Standard curve (BSA + DW + BCA solution)

② BCA solution = BCA : Cu⁺⁺ = 50 : 1

③ Sample (Protein + DW + BCA solution)

④ 96well plate에 standard와 sample을 넣고 50도에서 15분간 incubation시킨다. (standard, sample 모두 두 줄 반복)

⑤ 570㎜에서 흡광도 측정

⑥ Protein 양을 계산한다.

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3) Sample 만들기

① Protein lysate(cell에서부터 추출하여 계산한 양) + 5X loading buffer + Lysis buffer

② 5X loading buffer : SDS, b-mercaptoethanol, Bromophenol blue(색) 총 부피의 1/5

③ Lysis buffer : volume을 맞춰주기 위해 넣어주는 buffer

 

4) Sample loading

① Protein denaturation : 준비해 놓은 sample을 95도에서 5분간 반응

② Electrophoresis : 80～120V 에서 약 1시간 30분 전기영동

 

5) Protein transfer : 15V, 300mA 로 1hr 20분간 transfer

 

6) Staining : membrane으로 transfer가 잘 되었는지 확인함과 동시에 분자량 marker

 

7) Antibody reaction

① Blocking : 항체와의 비특이적 흡착을 방지하기 위해 하는 순서. 5% skim milk(in TBS-t) 넣고 약하게 1hr 간 흔들어준다.(gel의 높이를 같이해야 antibody와의 비특이적 흡착이 되지 않는다.)

② Primary antibody : 5% BSA에 1:200～1000 농도로 4℃에서 overnight shaking

③ Secondary antibody : TBS-t로 washing 후, 2차 항체(HRP)를 RT에서 1시간동안 shaking

 

8) Detection (ECL법)

① 2차 항체 붙이기가 끝나면 TBS-t로 washing

② ECL solution A : Solution B 1:1로 mix

③ Membrane에 mix된 ECL solution 고루 적시기

④ OHP film에 Membrane 올리고 fluorchem 기계로 현상.

⑤ 본 실험 5번 protein transfer까지만 같이 진행되었다.

 

 

 

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