1. 항원에 대한 항체의 특이적 결합을 이용하여 protein 혼합물로부터 어떤 특정 protein을 분석하는 Western blot의 원리를 이해한다.
2. protein의 SDS-PAGE분리, protein의 gel로부터 membrane으로의 transfer, 항체반응 및 항체에 부착된 효소의 반응에 의한 발색반응 등의 실험기법을 습득한다.
Western blot
정제를 할 때에는 이온 교환 형식만 가지고는 완벽하게 정제하기가 불가능 하다. 그래서 SDS-PAGE로 여러 protein이 섞인 것을 확인할 수 있다. 이제 그 안에 존재하는 protein 중에 어느 protein이 진짜 원하는 AP를 포함하고 있는지 확인해 보는데 이때 사용할 것이 Western blot이다.
Western blot으로 우리는 sample안의 무수히 많은 protein 중에 어떤 것이 진짜 원하는 AP인지 어느 sample에서 그 농도가 가장 높은지를 확인해 보고자 한다. 일단 가장 먼저 gel에 protein을 loading해서 내린다. 그 후 nitrocellulose membrane에 charge를 이용하여 protein을 붙인다. 그 이유는 gel은 gel 자체의 두께도 두꺼운 편이고 gel안에 protein이 들어있는 것이기 때문에 protein에 따로 항체를 붙이는 등의 처리를 하기 위해서는 따로 purification을 해야 한다.
그러나 nitrocellulose membrane의 경우에는 membrane 자체의 두께도 매우 얇고 질기며 잘 찢어지지 않아 편하게 실험할 수가 있다. 또한 membrane 겉에 protein을 붙이기 때문에 protein에 다른 처리를 하기에 용이하다. 이때 nitrocellulose membrane에 protein을 옮길 때는 이전 실험에서 protein을 – charge로 처리해 놓은 상태이기 때문에 gel을 –방향에 membrane을 +방향에 두고 charge를 걸어주면 +방향으로 protein이 옮겨가게 된다. 이때 이 protein은 따로 처리를 하지 않은 상태이기 때문에 나중에 따로 membrane에 항체 등으로 처리를 하여 눈에 보이게 염색을 해주어야 한다.
실험 방법
1. 실험 과정
1) SDS-PAGE gel에 protein marker(PM) 5µl와 각 sample 10µl를 loading한다.
2) 80V에서 30분 loading을 하고, running gel에 도착하면 160V로 1시간 loading한다.
3) fiber pad와 3㎜ paper는 먼저 Transfer buffer에 적셔둔다.
4) Plate에서 gel을 꺼내어 protein이 없는 stacking gel부분을 잘라내고 Transfer buffer에 담근다.
5) Transfer cassette의 한쪽 면 위에 fiber pad를 올리고 그 위에 3㎜ paper를 올리고, nitrocellulose membrane을 올린 후 gel을 넣고, 3㎜ paper로 다시 덮고, 그 위에 다시 fiber pad를 올려 Transfer cassette를 조립한다.
6) 조립을 완료한 후에 transfer tank에 Transfer cassette를 조립하고, power supply를 이용하여 electrophoretic transfer를 해준다. 이때 gel의 protein이 membrane으로 이동할 수 있도록 gel에 (-)charge를, membrane에 (+)charge를 걸어준다.
7) Transfer가 끝나면, blocking solution (3% skim milk)을 넣고 상온에서 1시간 동안 shaker에서 흔들어준다.
8) primary antibody를 1:5000으로 희석한 것을 넣은 3% Skim milk을 약 10㎖를 넣고 1시간 동안 shaker에서 섞어준다.
9) Primary antibody를 primary antibody를 모으는 통에 따라버린다.
10) 1X PBS-T 10㎖를 넣고 shaker에 5분 동안 흔들어주는 wash작업을 3번 실행한다.
11) 4+1:3000으로 희석된 Secondary antibody를 넣은 3% skim milk를 약 10㎖를 넣고 shaker로 1시간 동안 흔들어 준다.
12) Secondary antibody를 secondary antibody를 모으는 통에 따라 버린다.
13) 1X PBS-T 10㎖를 넣고 shaker에 5분 동안 흔들어주는 wash작업을 3번 실행한다.
14) 위 실험에서는 tween20을 쓸데 없는 antibody를 떨어뜨려서 비 특이적인 결합을 없애기 위해 PBS-T에 넣어 주었다. 그러므로 antibody들을 제거하기 위해 PBS-T를 이용하여 washing을 하는데 이때 tween-20이 washing의 효과를 높여준다.
15) 1X PBS-T를 버리고 염색을 해주는 TMB를 1㎖ membrane위에 고르게 뿌려준 뒤 잘 흔들어 준다.
16) 어느 정도 시간이 흐르면 반응을 확인한다.
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[생명과학실험]Western blot analysis 레포트
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