생화학실험 | Western Blotting - SDS-Page

 

 

TIP

 

 

1. 단백질을 크기별로 분리하는 기술로 항원-항체 반응을 이용하여 전체 단백질에서 특정 단백질만을 Detection 할 수 있다.
2. 본 Western Blotting은 뉴런으로 분화하기 전인 Neuroblastoma(Ne,신경모세포)를 사용해 신경모세포가 암이 되게 유발하는 단백질을 찾을 수 있다.

 

 

 

Gel electrophoresis에 대한 세부적인 이론이 복잡하고 현재로서는 불완전할지라도, 그 기본적인 개념은 쉽게 이해될 수 있다. 간단히 말해서 전기영동 분석은 전하를 띤 입자들이 외부에서 공급된 전기장의 영향을 받아서 반대 부호를 가진 전극 쪽으로 이동하는 데서 기인한다. 입자들의 움직임은 주위의 molecular sieve로서 역할을 하는 gel matrix와의 상호작용에 의해 지연된다.

 

전기장의 세기와 gel matrix의 pore size에 따라서 sample 안에 있는 단백질의 이동 속도가 달라진다. 일반적으로, 전기영동에 의한 분리는 분자의 크기, 모양, 전체 전하의 상대적인 양(net charges)에 기초한다. System은 전기영동 이동도(electrophoretic mobility)에 대한 크기, 모양, 전하의 효과를 구별할 수 없는 원래 형태(native configurations)에서 단백질을 분리하기 위해 구성된다.

 

 

실험 방법

1. 실험 과정

1) Sampling (Protein Extraction)

➀ 추출해 낼 세포에 Lysis buffer를 넣고 4℃에서 원심분리를 한다.(Lysis buffer는 세포막을 파괴하는 역할을 한다.)

➁ inner membrane과 outer membrane을 준비해 캐스터에 끼운 후 membrane 사이에 증류수를 넣어 물질이 새는지 시간을 두고 관찰한 뒤 새지 않으면 증류수는 버린다.

➂ 50㎖ 튜브에 폴리아크릴아마이드 3.4㎖, TDS와 SDS를 합하여 2.5㎖, D.W 4.1㎖를 넣고 혼합한 뒤 membrane 사이에 넣어준다.

➃ Lane을 표시할 comb를 넣는다.

➄ Gel을 굳힐 때는 10% AP(Ammonium Persulfate)와 TEMED를 사용한다.

 

2) SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate - poly acrylamid gel elextrophoresis)

➀ E-tube에 각각의 Sample 32㎕, 프루프 버퍼 8㎕ (SDS, Tris)를 넣는다. → Sample ①Ne ②Ne+RA(Retinoic Acid, 분화제) ③NE+Benzo[α]Pypene 0.1㎖ ④NE+Benzo[α]Pypene 0.3㎖ ⑤NE+Benzo[α]Pypene 1㎖ ⑥NE+Benzo[α]Pypene 3㎖ (SDS와 Tris가 단백질의 이황화 구조를 끊거나 3차 구조를 풀어 실처럼 만들고 모든 아미노산의 전하를 (-)로 바꿔 동일하게 만든다.)

➁ E-tube에 캡을 씌운 후 동동이에 띄워서 100도씨에서 5분간 끓인다. (끓인 후 Sample들은 얼음에 차갑게 보관한다.)

➂ Gel이 굳었는지 확인한 후 comb를 조심스럽게 빼낸다.

➃ membrane(inner membrane을 안쪽에 위치하도록 준비)과 running buffer(Tris+glycine+ 10% SDS)를 전기 영동기에 넣고 준비한다.

➄ lane 2부터 전기영동 기준이 되는 marker를 넣고, lane 3부터 lane 8까지 Sample을 8ul씩 채워넣는다. (이때 pipette tip은 끝이 얇은 로딩 팁을 쓰고 시료를 넣을 때 Gel이 상하지 않도록 주의한다.)

➅ 120V에서 1시간 20분 동안 전기영동을 진행한다.

 

3) Transfer

➀ 전기영동이 끝나면 membrane을 꺼내 Gel을 membrane으로부터 분리해낸 다음 Gel의 필요 없는 부분은 자르고 Washing한다.

➁ PVDF Transfer paper를 Gel 크기보다 조금 넉넉하게 자른 다음 Paper와 Gel을 Transfer buffer에 적신다.

➂ PVDF Transfer paper의 한쪽 귀퉁이를 잘라 방향을 표시해준다.

➃ 전기를 통하게 해주는 흑연판에 filter paper를 올리고 Transfer buffer로 적신다. 그 위에 PDVF Transfer paper와 Gel을 올린 뒤 다시 filter paper를 올리고 Transfer buffer로 적신다. 흑연판을 덮어 전기를 연결한다.

➄ 12V에서 1시간 15분 동안 Transfer를 진행한다.(이때 시간을 넘으면 paper가 손상될 수 있으므로 시간을 엄수한다.)

 

4) Blocking

➀ Transfer가 끝나면 paper를 5% Skim milk 40㎖에 넣어 60분간 rocking한다.

 

5) 항원-항체 반응

➀ 멸균된 비닐에 약간의 skim milk와 primary antibody를 넣고 비닐을 열로 완전히 봉한다.

➁ 편평한 판에 1을 붙여 수평을 유지하게 한 다음 4℃에서 overnight으로 1차 항원-항체 반응을 시킨다.

➂ 1차 항원-항체 반응을 완료한 paper를 TBST용액에 Shacking하며 10분, 5분, 5분, 5분, 5분 Washing한다.

➃ 1차 antibody 반응 과 마찬가지로 비닐에 secondary antibody를 넣고 비닐을 열로 가해 봉한 다음 판에 붙여 수평을 유지하게 한 다음 1시간 동안 shacking한다.

➄ 4가 끝난 paper를 TBST용액에 Shacking하며 10분, 5분, 5분, 5분, 5분, 5분, 5분 Washing 한다.

 

6) Fixer

➀ 암실에서 paper에 Film을 붙여 paper의 형광 발색된 부분을 exciting시킨다.

➁ Film을 Developer에 넣어 exciting된 부분을 태운다.

➂ 증류수에 Washing한다.

➃ Fixer에 넣어 고정시킨다. (이때 film의 형광 발색된 부분을 제외하고 암록색에서 청록색으로 변한다.)

 

 

 

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