SDS-PAGE로 단백질을 분리한 후 전기영동을 통해 단백질의 분자량을 측정, 단백질항체이용 분석을 할 수 있다.
Western Blot
표적 단백질에 대한 항체를 이용하여 항원-항체 반응으로 그 단백질을 확인하는 방법. 단백질을 비특이적으로 결합하는 nitrocellulose paper의 특성을 이용하여 SDS-PAGE 방법으로 분리된 단백질을 NC종이로 전기이동 시킨 다음 특정 단백질에 대한 항체를 이용하여 그 특정 단백질의 존재 여부, 위치, 양 등을 확인할 수 있다.
먼저 NC종이로 옮겨진 단백질이 더 이상 비특이적으로 결합하지 않게 하기위해서 blocking 한 후 특정 단백질에 대한 항체인 1차 항체를 결합시킨다. 항체에 대한 단백질의 결합은 특이적이므로 강하게 붙어 있는다. 이를 보기 위해서 2차 항체를 결합시킨 후 발광시약을 넣어 2차 항체를 발색시켜 단백질을 확인한다.
실험 방법
1. Sample 만들기
1) Sample을 다음 표와 같이 만든다. (㎕)
|
|
sample |
?/2㎕ |
?/1㎕ |
sample양 |
6x loading dye |
ddw |
total |
|
1 |
con 0h |
1.918 |
0.96 |
10.43 |
3 |
4.57 |
18 |
|
2 |
h.p 0.25h |
1.932 |
0.97 |
10.35 |
3 |
4.65 |
18 |
|
3 |
h.p 0.5h |
2.576 |
1.29 |
7.76 |
3 |
7.24 |
18 |
|
4 |
h.p 1h |
2.043 |
1.02 |
9.97 |
3 |
5.21 |
18 |
|
5 |
h.p 3g |
2.455 |
1.23 |
8.15 |
3 |
6.85 |
18 |
2) 오차를 줄이기 위해 물을 먼저 넣고 그 다음 loadingdye를 3㎕씩 넣는다. 다음 sample단백질을 넣는다.
3) 벽에 묻어있을 수도 있으니 원심분리 한다.
4) 만든 sample은 저장했다가 다음주 heating했다.
2. Western blot : Step 1
1) 단백질을 크기별로 분리하기 위한 separating gel을 만든다.
2) 만든 separating gel을 장치의 유리판 사이에 2㎖를 넣고 굳힌다. (약 30～60분) → 겨울에는 추워서 안굳고 여름에는 빨리 굳는다.
3) 굳은 gel 위에 butanol과 물을 넣어준다.
4) butanol을 버리고 DDW로 씻어준 후 남아있는 물기를 3MM paper로 제거한다.
5) Stacking gel을 만들어 separating gel위에 붓고 comb을 꽂는다.
6) sample을 99℃에서 7분간 heating한다.
7) stacking gel이 굳으면 comb을 빼고 standard marker와 sample을 loading한다. (18㎕)
8) 전기영동 해준다 (80-90V, 약 1시간 30분)
9) 전기영동이 끝나면 gel을 떼어내서 transfer buffer에 10~15분 정도 담가둔다.
10) nitrocellulose filter에 gel을 얹고 아래와 같이 장치한 후 transfer buffer를 장치안에 가득 붓는다.
11) 약 1시간 30분정도 transfer 한다.
12) transfer가 끝나면 ponceau를 넣고 단백질이 잘 옮겨졌는지 확인한다.
13) blocking buffer를 넣고 labeling 한후 shaker에 놔둔다. (40분)
14) blocking skim milk를 버리고 1차 antibody(primary antibody) 20㎕을 넣어 하루동안 반응시킨다.
3. Western blot : Step 2
1) 어제 만들었던 것을 PBS로 3번정도 washing 한다. (30분)
2) 2차 antibody(secondary antibody)를 붙인다. (1시간)
3) 그후 PBS로 30동안 washing한다. (10분에 한번씩 PBS를 부어준다)
4) 알코올을 책상위에 뿌리고 휴지로 펴준다음 알코올이 마르지 않게 하고 랩을 평평하게 덮는다.
5) 그 위에 paper를 올린다음 발광물질인 ECL시약을 1㎖ 넣고 랩으로 싼다.
6) 암실로 가서 20초동안 필름을 붙인다.
7) developer → DW → fixer(고정) → DW순으로 하고 washing한후 필름에 잘나왔는지 비교한다.
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SDS-PAGE에 의한 단백질 분리와 Western Blotting 레포트
1. 실험 목적 1.1. SDS-PAGE로 단백질을 분리한 후 전기영동을 통해 단백질의 분자량을 측정, 단백질항체이용 분석을 할 수 있다. 2. 실험 이론 및 원리 2.1. 전기영동의 원리 전기영동은 전기장을 이용하여 입자를 양극 또는 음극쪽으로 이동시키는 현상을 말한다. 이 때 이동하는 속도는 입자의 전하량, 크기와 모양, 용액의 pH와 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 이온의 세기, 지지체의 종류 등 여러 가지 요인에 의해 결정된다. 이 때
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