분자생물학개론 | Purification of DNA from Living Cells - 생세포로부터의 DNA 분리, 정제

 

 

 

TIP

 

 

1. Total cell DNA의 분리
2. 플라스미드 DNA의 분리
3. 박테리아파지 DNA의 분리

 

 

 

유전 공학을 위한 DNA분리는 3가지 유형으로 구분할 수 있다.

제 1 Type : 세포 전체 DNA(total cell DNA)이며 클로닝될 유전자를 얻기 위해 필요

제 2 Type : 순수한 플라스미드 DNA이며 분리방법은 기본적으로 total cell DNA분리와 같지만 어느 단계에서는 염색체 DNA와 분리되어야 한다.

제 3 Type : 파지 DNA이며 파지 클로닝 벡터로 이용될 때 필요. 파지 DNA는 감염세포로부터 보다는 파지 자체에서 분리되는 것이 일반적이기 때문에 세균 DNA에 의해 오염되는 문제는 없다. 그러나 파지 캡시드(단백질)를 제거하기 위해선 특수한 방법이 필요하다. 예외적으로 대장균(E. coli) 세포로부터 M13의 dsRF를 분리할 때는 플라스미드 분리 때와 같은 방법이 사용된다.

 

 

Total cell DNA의 분리

(1) 세균 배양물의 증식 및 수확

1) Defined medium : 배지의 모든 구성성분이 알려져 있는 배지로 정밀하게 통제되는 조건에서 세균 배양물을 증식시켜야 할 때 사용

 

2) Undefined medium : 배지의 구성성분에 대한 자세한 성분명과 함량이 알려져 있지 않은 배지로 단순히 DNA분리를 위한 경우에 적절

 

 

37℃, LB 배지, 150~250 rpm shaking incubator에서 E. coli의 generation time(doubling time)은 20분이고 최대 밀도(maximum density)인 약 2~3×10⁹ cells/㎖에 도달할 때까지 분열한다. 배양물의 증식 정도는 OD값 측정(600㎚)으로 알 수 있다. 수확은 late log phase 때 수행하는 것이 권장되고 있고, 형질 전환시에는 early log phase 때 즉 A₆₀₀ = 0.4일 때의 배양물을 사용한다. 적당히 증식된 세포를 원심분리 튜브(centrifuge tube)로 옮기고 원심분리 시킨 후, 상층액을 버리고 펠릿(pellet)을 작은 부피로 재현탁(resuspend) 시킨다.(배양액 1000㎖을 원심분리시킨 경우 pellet에 10㎖ 또는 그 이하의 배지를 붓고 재현탁 시킴)

 

 

(2) 세포 추출물의 분리

세포 추출물을 얻고자 할 때 몇 가지 장벽이 있다. 1) 세포막, 2) 세포벽, 3) 그람 음성 세균인 경우 outer membrane

 

세균 세포를 파괴시키는 방법에는 2가지가 있다.

1) 물리적 방법(physical methods) : 기계적인 힘으로 파괴하는 방법

 

2) 화학적 방법(chemical methods) : 세포 장벽(cell barrier)을 붕괴시키는 화학제를 사용하는 방법으로서, DNA분리를 위해 가장 일반적으로 사용되고 있다.

① lysozyme : 계란 흰자, 눈물, 타액(침)에 존재하는 효소로서, 세균 세포벽을 구성하는 중합체인 펩티도글리칸(peptidoglycan)의 β(1, 4)glycosidic bond를 절단

② EDTA(EthyleneDiamine TetraAcetate) : 세포벽의 전체구조를 유지시키는데 필수적인 Mg 이온을 제거하여 세포벽을 불안정화시키고, DNA분해효소를 불활성화시킴

③ SDS(Sodium Dodecyl Sulphate) : 세포막의 지질분자 제거

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(3) 세포 추출물로부터 DNA의 정제

원심분리에 의해서 세포 찌꺼기를 제거한 후에도 용액에는 DNA뿐 아니라 다량의 단백질과 RNA가 포함되어 있다.

 

1) 단백질 제거(Removing contaminants by organic extraction and enzyme digestion)

페놀 또는 페놀:클로로포름(phenol:chloroform)(1:1)을 첨가.

페놀은 유기용매로써 단백질을 변성, 침전시킴

 

 

한번의 페놀 처리로 단백질이 완전히 제거되지 않는 경우, 여러번 반복수행한다. 그러나 반복될수록 DNA가 절단될 가능성이 높아지기 때문에 단백질 분해효소(protease)를 처리하기도 한다.

① 페놀(1 Vol.) 처리 : 페놀은 비중이 높아서 가라 앉는다.

② Bacillus subtilis는 단백질 분비량이 많기 때문에 protease를 처리하는 것이 통상적이다.

 

2) RNA 제거 : RNase(RNA 분해효소)(Using ion-exchange chromatography to purify DNA from a cell extract)

어떤 RNA분자(mRNA)는 페놀 처리에 의해 제거되지만, 나머지는 그렇지 않으며 이들은 RNase(ribonuclease)를 이용하여 분해시킨다.

 

(4) DNA 샘플의 농축

가장 자주 사용되는 농축방법은 에탄올 침전법[ethanol(EtOH) precipitation]이다.

1) DNA : 음전하를 띠고 있음

2) 양전하를 띤 이온(1가의 양이온)을 이용

3) Ethanol(100%) 2 vol. 첨가

 

 

(5) DNA 농도의 측정

measured by ultraviolet(UV) absorbance spectrophotometry

양 : A₂₆₀ = 1 → 50㎍ ds DNA/㎖

순도 중요 : A₂₆₀/A₂₈₀(protein) 측정 비교한다. 비율이 1.8이상이면 순도 높고, 이하이면 순도 낮은 것이며 불순물이 많은 경우 페놀 처리부터 다시 한다.

 

(6) 세균 이외의 생물체로부터의 total cell DNA의 분리

실험 목적상 세균 이외의 생물체로부터 total cell DNA를 분리할 필요가 있다. 물론 세균에서의 경우와 동일하지 않으며, 차이점은 다음과 같다.

1) 세포 파괴 단계에서 차이점

식물 세포 : lysozyme이 효과가 없기 때문에 물리적 방법(냉동시킨 시료를 갈아서 부수는 등)을 사용하거나, cellulase[셀룰로스(식물 세포벽의 구성성분) 분해효소]를 사용하여 세포벽 파괴

동물 세포 : 세포벽이 없기 때문에 detergent 처리만으로 쉽게 용해시킬 수 있음.

 

2) 세포 추출물 내용물의 차이

세균 : 주로 단백질, DNA, RNA

식물 : 단백질, DNA, RNA 외에 다량의 탄수화물(광합성의 결과) 존재

① 탄수화물 제거를 위한 제 1 방법 : CTAB(CetylTrimethylAmmonium Bromide)라는 detergent 처리

② 탄수화물 제거를 위한 제2 방법

∘ 음이온 교환 크로마토그래피(anion-exchange chromatography) : 핵산(nucleic acid)이 음전하를 띠는 성질을 이용.

 

 

 

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