분자생물학개론 | Introduction of DNA into Living Cells - 생세포에서의 DNA 도입

 

 

 

TIP

 

 

1. 형질전환(Transformation) - 세균 세포에 의한 DNA uptake
2. 재조합체의 동정
3. Introduction of phage DNA into bacterial cells
4. Identification of recombinant phages
5. Transformation of non-bacterial cells

 

 

 

재조합 DNA 제조 후 다음 단계는 생세포(보통 세균)안으로 재조합 DNA를 도입시키는 것이며 그 세포는 클론을 생산하기 위해 성장, 분열하게 된다. 엄밀히 말해서, 클로닝이란 재조합 DNA제조 자체를 일컫는 것이 아니라 그 이후 과정만을 말한다.

 

 

형질전환(Transformation) - 세균 세포에 의한 DNA uptake

대부분의 세균 종들은 그들이 성장하는 배지로부터 DNA분자를 uptake할 수 있다. 이러한 방법으로 uptake된 DNA분자는 분해되지만(restriction and modification에 의해) 종종 생존하여 복제될 수 있다. 특히 이러한 현상은 그 DNA분자가 숙주에 의해 인식될 수 있는 복제 원점(replication origin)을 가지고 있는 플라스미드인 경우 나타난다. 플라스미드의 uptake와 안정적인 보존은 플라스미드가 가지고 있는 유전자의 발현을 관찰함으로써 탐지된다.

 

항생제에 민감한 세균 세포가 항생제-저항성 유전자를 가진 플라스미드를 uptake하여 이 유전자가 발현된 경우, 이 세균 세포의 항생제에 대해 민감한 형질은 저항성을 나타내는 형질로 전환된 것이다.(transform) 최근 형질전환이라는 용어는 의미가 확장되어 어떤 유형의 세포에 의한 어떤 DNA분자의 uptake 전부를 지칭하고 있다.

 

(1) DNA uptake 효율을 세균마다 다르다

대부분의 세균 종들은 정상조건에서 제한된 양의 DNA만을 uptake한다. Uptake 효율을 높이기 위해선 DNA를 uptake하는 능력을 향상시키는 물리적 및 화학적 처리를 해야 한다. 이러한 처리를 한 세포를 수용성(competent)이라 한다.

 

(2) 수용성 대장균 세포의 제조

50mM 염화 칼슘(calcium chloride)이 사용되는데, 이러한 현상이 왜 일어나는지 정확히 이해되지는 않았다. 가능한 것은 CaCl₂가 세포외부에 DNA가 침전되도록 하고 아마도 이 염(salt)이, DNA 결합이 향상되도록 세포벽에 어떤 변화(예컨대, 전하의 변경)를 일으킨다고 생각되고 있다. 수용세포 내로 DNA의 실제 이동은 42℃로 온도를 올려주는 것에 의해 자극된다. 이러한 heat-shock이 왜 효과적인지는 알려지지 않았다.

 

 

(3) 형질전환된 세포의 선별

예를 들어 1ng의 pUC8으로 1,000～10,000 형질전환체(transformant)가 생길 수 있지만 이것은 유용한 분자 전체의 0.01%에 불과하다. 게다가 10,000 형질전환체는 수용세포 배양물에 존재하는 전체 세포 수의 매우 작은 비율이다. 따라서 플라스미드를 uptake한 세포를 구별해야 할 필요가 있다. 이를 위해 선별 마커(selectable marker)를 이용한다. Selectable marker란 비형질전환체(non-transformant)가 가지고 있지 않은 새로운 특징을 형질전환된 세포에 제공하는 유전자를 말한다. 대부분의 플라스미드 클로닝 벡터는 숙주세포에 항생제 저항성을 제공하는 적어도 하나의 유전자를 가지고 있다.

 

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그러나 항생제에 대한 저항성은 단순히 플라스미드가 형질전환된 세포내에 존재하는 것에 달려있는 것이 아니라, 플라스미드의 저항성 유전자가 발현되어 항생제를 무독화시키는 효소가 합성되어야 한다. 저항성 유전자의 발현은 형질전환 직후에 시작되지만 항생제의 독성효과를 견디어 낼 만큼 충분한 효소를 보유하기 위해선 시간이 필요할 것이다.

 

이러한 이유로 형질전환된 세균을 heat-shock 처리 직후에 선별 배지(selective medium)에 플레이팅(plating)해서는 안되며 우선 항생제가 없는 배지에서 짧은 시간 동안 배양시켜야 한다. 그런 후에 형질전환된 세균이 플레이팅되어 항생제에 노출되었을 때 이들은 이미 생존할 수 있을 만큼 충분한 효소를 합성하고 있을 것이다.

 

① 플라스미드에 의해 운반된 selectable marker를 이용한다.

② selectable marker란 non-transformant는 가지고 있지 않는 새로운 특징을 가진 transformed cell을 선별하기 위한 gene이다.

③ a good example : ampicillin resistance gene of pBR322

④ transformant는 plating out하기 전에 incubation time을 주는데(적용시키는데) 그 이유는 foreign DNA의 발현을 위한 시간을 제공하여 selective medium에서 transformant의 생존을 향상시키기 위해서이다.

 

 

 

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