분자생물학개론 | Cloning vector for E. coli

 

 

 

TIP

 

 

1. Cloning vectors based on E. coli plasmids 
2. Cloning Vectors Based on M13 Bacteriophage 
3. Cloning Vectors Based on λ Bacteriophage 
4. λ and other high capacity vectors enable genomic libraries to be constructed 
5. Vectors for other bacteria

 

 

 

1. Cloning vectors based on E. coli plasmids

Gene cloning에서 가장 널리 사용되는 가장 단순한 cloning vector들은 작은 bacterial plasmid에 기초하고 있다. 매우 많은 plasmid vector들이 상업적으로 공급되고 있으며 대부분의 평범한 gene cloning 실험은 이러한 plasmid vector 들 중 하나 이상을 사용한다.

 

 

• 가장 간단한 클로닝 벡터 그리고 유전자 클로닝에서 가장 많이 쓰이는 클로닝 벡터는 플라스미드임

• 구입가능

• 높은 형질전환 효율, 형질전환체와 재조합 분자들에 대한 편리한 선별표식자, 비교적 큰 DNA 단편(약8Kbp) 클론 가능, 정제의 용이함

 

(1) The nomenclature of plasmid cloning vectors

1) nomenclature

 

(2) The useful properties of pBR322

1) pBR322의 첫 번째 유용한 특징은 크기이다. (4363bp) 이는 벡터 그 자체가 쉽게 정제될 수 있다는 것뿐만 아니라 재조합 DNA 분자의 크기가 6Kb일지라도 재조합 분자는 여전히 다룰만한 크기가 될 것이다.

 

2) 두 번째 특징은 항생제 저항 유전자 두 세트를 지니고 있다는 것이다. Ampicillin, 혹은 tetracycline 저항은 플라스미드를 포함하는 세포에 대해 선별표식자로써 사용될 수 있으며 각 표식자 유전자는 클로닝 실험에 사용될 수 있는 독특한 제한부위를(restriction site) 가지고 있다.

PstⅠ, PvuⅠ 혹은 ScaⅠ으로 절단된 pBR322속으로 새로운 DNA를 삽입하는 것은 ampR 유전자를 비활성화 시키며 8개의 제한효소 중 어느 하나에 삽입하는 것은 tetracycline 저항성을 비활성화 시킨다. 삽입 비활성화에 사용될 수 있는 제한 부위의 대단한 다양성은 pBR322가 여러 가지 종류의 sticky 말단을 가진 DNA 단편을 클론시키는데 사용될 수 있다는 것을 의미한다.

 

3) 세 번째 잇점은 비교적 높은 복사수를 가진다는 것이다.(high copy number) 일반적으로 형질 전환된 대장균 세포에 존재하는 분자가 약 15개(분자/세포)지만, 이는 chloramphenicol과 같은 단백질 합성 억제제 존재하에서 플라스미드 증폭에 의해 1000～3000개까지 증가될 수 있다. 그러므로 대장균 배양은 재조합 pBR322 분자를 높은 수율로 제공할 것이다.

 

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(3) The pedigree of pBR322

1) 원천적으로 ampR 유전자는 자연에 존재하는 대장균의 전형적인 항생제 저항성 플라스미드인 플라스미드 R1에 존재한다.

2) TetR 유전자는 두 번째 항생제 저항성 플라스미드인 R6-5에서 얻어졌다.

3) 숙주세포에서 벡터의 증식을 지시하는 pBR322 복제 시작점은 원천적으로 pMB1으로부터 얻어졌으며, pMB1은 콜리신 생성 플라스미드 ColE1과 관계가 있다. 그래서 Cloning vector로서 pBR322의 주목할 만한 편리성은 우연히 생긴 것이 아니라 구상된 것이다.

 

 

 

 

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