분자생물학개론 | Manipulation of Purified DNA - 정제된 DNA의 조작

 

 

 

TIP

 

 

1. DNA를 조작하기 위해 사용되는 효소들의 종류
2. DNA 절단용 효소 : 제한 효소(Restriction endonucleases)
3. Ligation - DNA 분자들을 서로 연결시키기

 

 

 

1. DNA를 조작하기 위해 사용되는 효소들의 종류

이들 효소는 이들이 촉매하는 반응의 유형에 따라 5가지로 나눌 수 있다.

 

 

(1) 핵산 분해 효소(Nucleases) : 포스포디에스테르 결합을 끊음으로써 DNA 분자들을 분해시킴

 

 

1) Exonuclease(엑소뉴클레아제 또는 외부 핵산 분해 효소) : DNA 말단부터 한번에 하나씩의 뉴클레오티드를 제거시키는 효소로서, 이중가닥을 공격할 때 분해시키는 가닥의 수로 세분한다.

① BAL31(from the bacterium Alteromonas espejiana) : blunt(블런트 또는 평활) 말단(end) 만들면서 2가닥을 전부 제거

② Exonuclease III(from the bacterium E. coli) : sticky(스틱키 또는 점착) 말단(end) 만들면서 3'말단쪽의 뉴클레오티드를 하나씩 제거

 

 

2) Endonuclease(엔도뉴클레아제 또는 내부 핵산 분해 효소) : DNA 분자내부의 포스포디에스테르 결합(phosphodiester bond)을 절단

① S1 nuclease(from the fungus Aspergillus oryzae) : ssDNA(단일 가닥 DNA)뿐 아니라, dsDNA(이중 가닥 DNA)의 갭(gap) 등에 의해 생성된 단일가닥 부위 모두를 절단

② DNase I(from cow pancreas) : 단일 및 이중 가닥 DNA에 모두 작용

③ A restriction endonuclease(일반적으로 `제한 효소'라 부름) : 특정 염기서열을 인식하여 그 인식부위에만 작용

 

 

(2) 리가제(Ligase)

세포에서 DNA 리가제의 기능은 DNA복제동안 이중가닥의 DNA에 발생하는 닉(nick)을 복구하는 것이다.

리가제는 또한 이중가닥 DNA 단편들을 서로 연결시킬 수 있다.

1) Functions of Ligase

① nick repair

② joining two molecules

 

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(3) 중합 효소(Polymerase)

1) 기본 반응 : 주형, 프라이머, dNTPs의 존재하에서 새로운 가닥 합성, 유전공학에서 3가지 유형의 DNA 중합 효소가 주로 사용된다.

2) DNA 중합 효소 I(중합 반응 및 분해 활성; from E. coli) : 대부분이 이중가닥인 DNA중에서 짧은 단일가닥 부위인 gap뿐만 아니라 기존의 뉴클레오티드까지 대체시킨다.

3) 클레나우 단편(the Klenow fragment) : DNA pol I의 뉴클레아제 활성을 담당하고 있는 323번째 아미노산 부위를 제거시킨 효소로 gap만을 filling해 주는(채우는 또는 메우는) 효소

4) 역전사 효소(reverse transcriptase) : RNA 주형으로부터 새로운 DNA 가닥 합성하는 효소

 

 

(4) DNA modifying enzymes

1) 알칼라인 인산분해효소(alkaline phosphatase)(from E. coli or calf intestinal tissue) : 5' 말단에 존재하는 인산기를 제거하는 효소

※ 벡터+외래 DNA 연결시 벡터 DNA의 자가 연결(self-ligation)을 방지하기 위해 alkaline phosphatase를 사용하여 벡터 DNA의 5'-P의 P를 제거하여 5'-OH로 만든다.

2) 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase)(from E. coli infected with T4 phage) : free 상태의 5' 말단에 인산기를 첨가시키는 효소

3) 말단 데옥시뉴클레오티드 전달효소(terminal deoxynucleotidyl transferase)(from calf thymus tissue) : 3' 말단에 하나 이상의 데옥시뉴클레오티드를 첨가시키는 효소

 

 

(5) 토포아이소머라제(Topoisomerase)

초나선(supercoil)을 도입시키거나 제거시킴으로써 cccDNA(covalently closed-circular DNA)의 conformation(컨포메이션 또는 형태)을 변화시킬 수 있는 효소.

 

 

 

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