Biology/분자생물학

분자생물학개론 | Studying gene expression and Function

곰뚱 2019. 12. 3.

TIP

1. Studying the transcript of a cloned gene
2. Studying the regulation of gene expression
3. Identifying and studying the translation product of cloned gene

모든 유전자들은 기능하기 위해 발현되어야만 한다. 발현의 첫번째 단계는 상보적인 RNA가닥으로 유전자가 전사되는 것이다. 일부 유전자 - 예를 들어 tRNA 그리고 rRNA분자들을 암호화하고 있는 유전자 - 에서는 전사체 자체가 기능적으로 중요한 분자이다. 다른 유전자들의 경우에, 전사체는 단백질 분자로 번역된다. 유전자가 어떻게 발현되는지를 이해하기 위해서는 RNA 전사체를 연구해야만 한다.

특히 분자생물학자는 그 전사체가 원본 유전자에 충실한 복사본인지, 또는 유전자의 어떤 부분들이 그 전사체로부터 제거되는지를 알고 싶어할 것이다. 이렇게 제거되는 조각들을 intron이라 부르며 그들의 구조와 가능한 기능에 대해 상당한 관심이 집중되고 있다. Intron에 추가적으로, 전사의 시작과 종료에 대한 정확한 위치가 중요하다. 대부분의 전사체들은 유전자 자체 뿐만 아니라 그것의 양쪽 측면으로 확장된 nucleotide region의 복사본이다. 전사과정의 시작과 종료를 결정하는 신호들은 부분적으로만 이해되고 있다.

728x90

Studying the transcript of a cloned gene

대부분의 전사체 분석방법들은 적절한 유전자를 가지고 있는 DNA단편과 RNA전사체 사이의 혼성화에 기초하고 있다.

(1) Electron microscopy of nucleic acid molecules

전자 현미경법은 핵산분자를 육안으로 확인하기 위해 이용될 수 있다. 이를 위해 우선 polynucleotide를 화학제로 처리하여 그들의 직경을 증가시킨다. 처리되지 않은 분자들은 너무 가늘어서 관찰될 수 없다. 보통, DNA분자를 polynucleotide와 결합하는 cytochrome c같은 단백질과 혼합시킴으로써 가닥들을 두꺼운 shell로 coating시킨다. Coating된 분자들을 uranyl acetate 또는 어떤 다른 electron-dense material로 염색시킨다.

과거에, 전자 현미경법은 서로 다른 DNA분자사이의 혼성화를 분석하기 위해 주로 사용되어 왔다. 그러나 최근에 그 기술은 DNA-RNA hybrid의 연구에서 점차 중요해지고 있다. 그것은 어떤 유전자가 intron을 가지고 있는지를 결정하는 데 특히 유용하다. 어떤 유전자를 포함하고 있는 DNA가닥과 그것의 RNA 전사체 사이의 hybrid 모습을 생각해 보자.

그 유전자가 intron들을 가지고 있다면 DNA가닥의 그 부위들은 RNA전사체와 상동성이 없을 것이고 따라서 염기쌍을 이룰 수 없다. 대신 그들은 loop를 형성할 것이다. 이들 loop의 수와 위치는 그 유전자에서 intron들의 수 그리고 위치와 직접적으로 대응한다. 따라서 sequencing에 의해 얻어진 것 이상의 정보를 얻을 수 있으며 intron의 경계를 나타내는 특징들을 알아낼 수 있다.

(2) Analysis of DNA-RNA hybrids by nuclease treatment

DNA-RNA hybrid를 연구하기 위한 두번째 방법은 단일가닥에 특이적으로 작용하는 S1같은 nuclease와 관련이 있다. 이 효소는 단일가닥 상태의 DNA 또는 RNA polynucleotide를 분해시킨다. 만일 어떤 유전자를 가지고 있는 DNA분자가 그것의 RNA 전사체와 혼성화되어 있고, 그 후에 S1 nuclease로 처리된다면, 혼성화되지 않은 단일가닥 DNA부위가 분해될 것이다. 그 결과 간간히 nick을 가진 DNA와 연속적인 RNA가닥으로 이루어진 이중가닥이 남게 된다. 만일 RNA가닥을 alkali처리에 의해 분해시킨다면, 단일가닥 DNA단편들을 회수할 수 있다.

불행하게도 위 그림에서 보여지는 조작을 통해선 많은 정보를 얻을 수 없다. S1 nuclease digestion으로부터 보호된 DNA단편들의 크기는 전기영동에 의해 측정될 수 있지만, 그들의 순서 또는 상대적인 위치는 결정될 수 없다. 하지만 이 기술을 약간 수정하면 전사체와 intron의 자세한 출발점과 종결점을 mapping할 수 있다.

Leader sequence 300bp와 coding region(=gene) 100bp를 포함하는 Sau3A단편을 M13 vector에 cloning하여 단일가닥 분자를 얻는다. RNA 전사체 중 한 시료를 첨가하여 DNA분자와 결합시킨다. DNA분자는 주로 단일가닥이지만 RNA 전사체와 결합한 부위는 이중가닥이다. S1 nuclease와 alkali처리를 하면 짧은 단일가닥 DNA단편이 남게 된다. 이 실험으로 전사 개시점과 오른쪽의 Sau3A site사이의 거리와 상응하는 단일가닥 단편의 크기를 알아낼 수 있다. 그 단일가닥 단편의 크기를 전기영동에 의해 결정하고, 이 정보는 DNA서열상에서 전사 개시점의 위치를 결정하기 위해 이용된다.